Här presenteras ett protokoll för att generera formalinfixerade, paraffininbäddade cellpelletskontroller för immunhistokemi.
Positiva och negativa kontroller med känt uttryck av målproteiner är avgörande för utvecklingen av immunohistokemiska analyser (IHC). Medan vävnadskontroller är fördelaktiga för väl karakteriserade proteiner med definierade vävnads- och cellulära uttrycksmönster, är de mindre lämpliga för den initiala utvecklingen av IHC-analyser för nya, dåligt karakteriserade eller allestädes närvarande uttryckta proteiner. Alternativt, på grund av deras standardiserade natur, kan cellpellets, inklusive cancercellinjer med definierade protein- eller transkriptuttrycksnivåer (t.ex. högt, medium och lågt uttryck), transfekterade överuttryckande cellinjer eller cellinjer med gener som raderats genom cellteknikteknik som CRISPR, fungera som värdefulla kontroller, särskilt för den initiala antikroppskarakteriseringen och urvalet. För att dessa cellpellets ska kunna användas vid utvecklingen av IHC-analyser för formalinfixerade, paraffininbäddade vävnader måste de bearbetas och bäddas in på ett sätt som rekapitulerar de procedurer som används för vävnadsbehandling. Detta protokoll beskriver en process för att skapa och bearbeta formalinfixerade, paraffinbäddade cellpelletskontroller som kan användas för IHC-metodutveckling.
Immunohistokemi (IHC) är en av de vanligaste analyserna inom undersökande och diagnostisk patologi. Beroende på sammanhang och analys används IHC för att hjälpa till med cancerdiagnos1,2, förutsäga behandlingssvar3,4, identifiera patogener5, karakterisera celltyper i sjuka vävnader6 och studera biologiska vägar och vävnadssvar 7,8. I alla situationer är grundprincipen för en IHC-analys att en antikropp binder specifikt till ett mål av intresse, oftast ett protein, och denna bindningshändelse visualiseras därefter i en vävnadssektion9. En av de största utmaningarna med någon IHC-analys är dock att säkerställa att antikropparna specifikt detekterar målet av intresse10. Antikroppsspecificitet är en utmaning i de flesta immunanalyser, men immunhistokemi erbjuder unika utmaningar genom att det inte finns några sekundära åtgärder, såsom molekylvikt, för att skilja mellan specifik och ospecifik märkning. Detta är särskilt besvärligt när man utvärderar dåligt karakteriserade eller allestädes närvarande uttryckta mål som saknar väldefinierade cellulära lokaliseringsmönster. Därför är robusta kontroller som kan hjälpa till att karakterisera bindningsspecificitet avgörande när man utvecklar en ny IHC-analys10.
För mål som är väldefinierade med karakteristiska cellulära uttrycksmönster används vävnadskontroller ofta i IHC-metodutveckling. Baserat på en mängd tidigare data kan man avgöra om antikroppen märker vävnaden, cellen och det subcellulära facket där det är känt att det uttrycks, och att det inte märker vävnadskomponenter där det inte borde vara närvarande11. Vävnadskontroller är dock av begränsad användning för dåligt karakteriserade, nya mål utan kända uttrycksmönster eller för proteiner som är allmänt uttryckta och saknar distinkta uttrycksmönster. I båda dessa scenarier gör avsaknaden av ett väldefinierat uttrycksmönster det omöjligt att skilja specifikt från icke-specifik märkning i vävnader. I dessa situationer erbjuder cellpellets en värdefull alternativ IHC-kontroll. Cellpelletskontroller kan inkludera: cancer eller andra cellinjer som har endogena eller inneboende / icke-inducerade uttrycksnivåer av proteinet av intresse, och vars proteinuttryck kan karakteriseras av western blotting, flödescytometriska analyser eller extrapoleras från transkriptionell profilering; konstruerade cellinjer som antingen överuttrycker proteinet av intresse eller har den kodande genen av intresse raderad; eller celler som har behandlats under särskilda förhållanden för att inducera proteinuttryck eller signalhändelser av intresse (t.ex. fosforylering)10,12. Väl karakteriserade proteinuttrycksnivåer i cellinjer möjliggör också utvärdering av känsligheten hos en analys genom att använda en panel av cellinjer med högt, medium, lågt och frånvarande proteinuttryck. Dessutom kan konstruerade cellpellets vara värdefulla artspecifika kontroller för veterinära arter, för vilka det kan finnas begränsad karakterisering eller tillgängliga vävnadskontroller13. Medan cellpellets har sina begränsningar, såsom det begränsade proteomet som finns i cellinjer som inte kommer att återspegla det olika proteomet i vävnader, fungerar de som lämpliga kontroller för att bekräfta att antikroppen kan detektera målet av intresse samt utesluta urskillningslös bindning av den primära antikroppen, sekundär antikropp eller andra regenter i analysen10.
De flesta vävnader i diagnostisk och undersökande patologi fixeras i neutralt buffrat formalin, dehydreras i en serie alkoholer, rensas i xylen och bearbetas och inbäddas i paraffinvax. Formalinfixering tvärbinder proteiner och fixering och varje ytterligare steg i vävnadsbehandling kan direkt påverka proteiner och antikroppars förmåga att detektera dem 9,14. Därför är det viktigt att alla kontroller som används i en IHC-analys genomgår samma fixering, vävnadsbehandling och inbäddningsprocedurer. Denna artikel beskriver de unika övervägandena för att bearbeta och bädda in odlade celler för att fungera som kontroller för att utveckla IHC-analyser i formalinfixerade paraffinbäddade vävnader, med metodiken främst inriktad på hantering och bearbetning av cellpelleten i ett histologilaboratorium.
Detta protokoll beskriver en metod för att generera formalinfixerade, paraffininbäddade cellpellets som kan användas som kontroller för nedströms immunhistokemi och in situ hybridiseringsstudier. De histologimetoder som beskrivs i detta protokoll är tillämpliga på ett varierat spektrum av cancer- och primära cellinjer och anpassar främst rutinmässiga histologitekniker för att producera dessa pellets17,18. Vid bearbetning och inbäddning kan pelletsna användas på liknande sätt som vävnader. Detta inkluderar att använda dem med värmeinducerade och enzymatiska antigenhämtningsprotokoll för immunhistokemiska experiment. Ett syfte med de metoder som används i detta protokoll är att bevara cellernas morfologi och antigenicitet under hela processen. Därför används EDTA, som är relativt mild när det gäller förändringar i både morfologin och antigeniciteten, för att lossa cellerna. Detta betyder inte att andra tillvägagångssätt, såsom fysiska störningar, inte är livskraftiga; Varje tillvägagångssätt för att lossa celler bör dock säkerställa att cellerna inte skadas i processen. Det andra syftet med detta protokoll är att fixera och bearbeta cellerna på ett sätt som liknar vävnader, med samma fixerings-, fixativförhållande, bearbetningsschema (fixering, uttorkning, clearing och paraffininfiltration) och inbäddningstekniker, så att de kan fungera som jämförbara kontroller för nedströmsanalyser. Därför bör de fixerings- och bearbetningsmetoder som används för att generera cellpellets efterlikna de metoder som används för vävnader.
Protokollet som beskrivs i denna rapport är inte anpassat för att hantera celler med smittämnen, såsom celler infekterade med patogena bakterier eller virus, eftersom celler lossnar, samlas in och centrifugeras före fixering. Utredare kan överväga protokoll för att fixa cellerna före lossning, men detta skulle kräva ytterligare optimering för att samla cellerna utan att störa cellmorfologin. Dessutom kräver fixeringstider och hanteringsförhållanden för celler med smittämnen ytterligare överväganden baserade på smittämnet och tillhörande institutionella biosäkerhetsprotokoll.
Formalinfixerade, paraffininbäddade cellpellets är unikt fördelaktiga för att ha väldefinierade proteinuttrycksnivåer10. Medan cancer och endogena cellinjer erbjuder ett urval av celler med varierande nivåer av proteinuttryck, gör genteknikteknik det möjligt för forskare att modellera proteinuttrycket genom överuttryckande proteiner av intresse och användning av CRISPR-teknik för att skära ut eller infoga kodande gener av intresse20,21 . Nackdelen med överuttryckta proteiner i cellinjer är att de är dåliga mått på känsligheten hos en analys eftersom de kanske inte representerar endogena proteinnivåer22. Däremot kan både endogena cellinjer och cancercellinjer bättre representera endogena uttrycksnivåer, och CRISPR-medierad radering av den kodande genen i en kognatlinje kan fungera som en motsvarande negativ kontroll. Dessutom är endogena cellinjer eller cancercellinjer med varierande nivåer av proteinuttryck idealiska för titreringsexperiment för att välja slutliga antikroppsutspädningar och för att bäst förstå känsligheten hos en analys (figur 2). Beslutet kring vilka cellinjer som ska användas bör baseras på individuella experimentella behov och kommer ofta att använda en kombination av tillvägagångssätt.
Förutom att utvärdera om en antikropp kan detektera proteinet av intresse, kan en panel av cellinjer användas för att definiera en antikropps specificitet. Till exempel kan en panel av cellinjer som individuellt uttrycker en familj av närbesläktade proteiner användas för att testa om en antikropp är specifik för ett enskilt protein eller om den också detekterar andra närbesläktade proteiner. Mer detaljerade kontroller kan innebära att man använder cellinjer som uttrycker, antingen genom CRISPR-knock-in eller genom överuttryck, proteiner med punktmutationer som inte kan genomgå specifika signalhändelser som detekteras (t.ex. mutation på specifika fosforyleringsställen vid utvärdering av en fosfospecifik antikropp). Även om dessa är mer komplexa tillvägagångssätt kan de vara nödvändiga för att bekräfta att antikroppen endast använde etiketter under specifika omständigheter10.
Det är viktigt att notera att genetiska manipuleringar av cellinjer kanske inte genererar en homogen cellpopulation. Till exempel är transfektionseffektiviteten vid överuttryck av cellinjer vanligtvis inte 100% och vissa celler kanske inte överuttrycker proteinet av intresse. Inkludering av FLAG eller en relaterad tagg i transfektionen som kan detekteras med standardmetoder kan vara till hjälp för att bedöma transfektionseffektiviteten hos cellinjen23. Detta kan vara till hjälp både för att avgöra om transfektionen lyckades och utesluta brist på detektion på grund av proteinuttrycket, och för att fungera som referens för den förväntade andelen celler som bör uttrycka proteinet av intresse.
In situ hybridisering (ISH) kan också vara ett fördelaktigt verktyg för att karakterisera målgenuttrycket i cellpellets och informera IHC-metodutveckling10. Vid screening av antikroppar kan det vara informativt att veta när transkriptet, och därmed det potentiella proteinet, kan detekteras. Dessutom kan cellpellets ISH-screening vara till nytta för ISH-metodutveckling. Även om specificitet är mindre ofta ett problem för ISH-analyser, är det fortfarande viktigt att ha lämpliga kontroller och liknande överväganden för utveckling och användning av kontroller som kan tillämpas på ISH-studier.
Vävnadsmikroarrayer skapas genom att ta bort kärnor från givarblock och överföra dessa kärnor, ofta i ett rutmönster, till ett mottagarparaffinblock. I slutändan innehåller mottagarblocket ett spektrum av prover i ett enda block, vilket gör det möjligt för alla prover i blocket att gå igenom identiska IHC-procedurer och möjliggöra direkt jämförelse av flera prover på samma bild24,25. Eftersom cellpellets är relativt enhetliga populationer kan de representeras exakt av 1 mm kärnor, vilket gör dem till idealiska kandidater för inkludering i liknande arrays. Med hjälp av en cellpelletsuppsättning är det möjligt att inkludera cellpellets med varierande uttrycksnivåer, cellpellets som unikt uttrycker relaterade proteiner och cellpellets som uttrycker ortologer av proteinet av intresse från olika arter i en enda bild (figur 3). Detta gör att alla cellpellets kan utvärderas samtidigt under enhetliga förhållanden på ett snabbt sätt, samtidigt som användningen av reagenserminimeras 25.
För detta protokoll rekommenderas en minsta startcellpelletsvolym på 2 ml som samlats in från åtta T175-kolvar. Denna volym möjliggör produktion och arkivering av flera cellpelletsblock, så att cellpelletskontroller kan standardiseras över längre tidsperioder och flera cellpelletsmatriser kan skapas från en given pellets. Lägre cellpelletsvolymer kan användas vid hantering av primära patient-härledda cellinjer, långsamt växande cellinjer eller när förhållandena begränsar provets volym. Naturligtvis kommer lägre startvolymer att förstärka den negativa påverkan från eventuell cellförlust under fixering och beredning av pelleten och kommer att begränsa det material som är tillgängligt för nedströmsprocesser. Det är särskilt viktigt att vara försiktig när du tar bort fixativ efter centrifugering för att minimera eventuell tillhörande förlust. För lägre provvolymer kan ett 1,5 ml, täckt centrifugrör användas för att pelletera cellerna. Dessa rör kan korsas i längdriktningen med ett blad för bearbetning.
I likhet med vävnadsfixering är cellfixering inom denna pellet avgörande för nedströms IHC-bedömningar. För att uppnå fullständig fixering använder vi minst ett 10: 1 formalin till cellpelletsförhållande och inverterar det koniska röret för att hålla cellerna i suspension. Om cellerna inte är i suspension vid tidpunkten för fixeringen finns det risk för ofullständig eller otillräcklig fixering, vilket kommer att påverka nedströms immunmärkning. Ofta manifesteras detta som stark märkning i periferin och förlust av märkning i mitten av pelleten eller märkning av varierande intensitet i hela pelleten.
Detta protokoll använder Histogel, som huvudsakligen består av hydroxietylagaros, för att både binda cellpelleten och för att göra det möjligt för cellerna att fördelas jämnt över cellpelleten. Utan det blir cellerna komprimerade och förlorar sina cytomorfologiska detaljer. Dessa cytomorfologiska detaljer är ofta viktiga under antikroppsscreening, eftersom de ger ytterligare information om huruvida antikroppen är märkt i lämpligt subcellulärt fack (t.ex. kärnan, cytoplasman eller plasmamembranet). Däremot kan för mycket gel resultera i lägre celltätheter i pelleten, vilket leder till att cellerna distribueras brett och minskar cellantalet per sektion.
Detta protokoll kan rutinmässigt användas för att utveckla IHC-kontroller. Materialen som behövs för att skapa dessa pellets är vanliga i undersökande biologi- och histologilaboratorier, och metoderna är enkla och lätta att anpassa. Medan cellpellets har begränsningar som IHC-kontroller, fungerar de som bra verktyg för initial antikroppsscreening och kompletterar andra vävnadskontroller.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill uppmärksamma samarbetet mellan våra kollegor i Genentechs forskningsorganisation, och särskilt patologikärnlaboratorierna (P-core) som bidragit till utvecklingen av dessa metoder genom åren.
10% Neutral Buffered Formalin | VWR | 16004-128 | |
50 mL Conical Tube | Becton Dickinson Labware | #0747-1886 | |
70% Ethanol | Koptec | V1401 | |
95% Ethanol | Koptec | V1101 | |
Biopsy Wraps | Surgipath Medical Industries, Inc | #01090 | |
Costar Stripette serological pipette 10mL | Corning | CLS4101 | |
Flex 100 | Epredia | 8101 | |
Flex 95 | Epredia | 8201 | |
Histogel | Thermo Scientific | #R904012 | |
Leica Automated Rotary Microtome | Leica | RM2255 | |
Micro Spatula, rounded and tapered ends | Tedd Pella | #13510 | |
NanoZoomer 2.0 HT whole slide imager | Hamamatsu | ||
Paraplast Tissue Infiltration/Embedding Paraffin | Surgipath | 39601006 | |
Pipette Controller | CAPP | PA-100 | |
Reagent Alcohol | Epredia | 9111 | |
Sterling Probe 5” 2mm Tip with Eye | Roboz Surgical Instrument Co., Inc | #RS-9522 | |
Superfrost Plus positively charged microscope slides | Thermo Scientific | 6776214 | |
Tissue cassettes; PrintMate Slotted Cassette | Epredia | B851120WH | |
TMA Tissue Grand Master | 3DHistech LTD | ||
Xylenes | VWR | 89370-088 |