福尔马林固定、石蜡包埋细胞沉淀免疫组化对照的标准化处理

Summary

这里介绍的是用于生成用于免疫组织化学的福尔马林固定、石蜡包埋的细胞沉淀对照的方案。

Abstract

具有已知靶蛋白表达的阳性和阴性对照对于免疫组织化学（IHC）测定的发展至关重要。虽然组织对照有利于具有明确组织和细胞表达模式的表征良好的蛋白质，但它们不太适合针对新型、表征不佳或普遍表达的蛋白质的 IHC 测定的初始开发。或者，由于其标准化性质，细胞沉淀，包括具有确定的蛋白质或转录表达水平（例如，高、中和低表达）的癌细胞系）、转染的过表达细胞系或通过CRISPR等细胞工程技术删除基因的细胞系，可以作为有价值的对照，特别是对于初始抗体表征和选择。为了使这些细胞沉淀用于开发福尔马林固定石蜡包埋组织的IHC测定，需要以概括组织处理程序的方式对其进行处理和包埋。该协议描述了创建和处理福尔马林固定、石蜡包埋的细胞沉淀对照的过程，可用于IHC方法开发。

Introduction

免疫组织化学（IHC）是调查和诊断病理学中最常用的检测方法之一。根据上下文和测定，IHC用于协助癌症诊断¹，2，^预测治疗反应3，4，^鉴定病原体⁵，表征患病组织中的细胞类型6，以及研究生物学途径和^{组织反应7，8}。在所有情况下，IHC测定的基本原理是抗体特异性结合目标靶标，最常见的是蛋白质，并且该结合事件随后在组织切片⁹中可视化。然而，任何IHC检测的最大挑战之一是确保抗体特异性检测目标靶标¹⁰。抗体特异性在大多数免疫测定中是一个挑战，但免疫组织化学提供了独特的挑战，因为没有二级指标（如分子量）来区分特异性和非特异性标记。在评估表征不良或普遍表达且缺乏明确定义的细胞定位模式的靶标时，这尤其麻烦。因此，在开发新的IHC检测方法¹⁰时，有助于表征结合特异性的稳健质控至关重要。

对于具有特征性细胞表达模式的明确定义的靶标，组织对照经常用于IHC方法开发。基于丰富的先前数据，可以确定抗体是否标记了已知表达的组织、细胞和亚细胞区室，并且它没有标记不应存在的组织成分¹¹。然而，组织对照对于表征不良、没有已知表达模式的新靶标或广泛表达且缺乏独特表达模式的蛋白质的用途有限。在这两种情况下，由于缺乏明确的表达模式，因此无法区分组织中的特异性和非特异性标记。在这些情况下，细胞沉淀提供了一种有价值的替代IHC对照。细胞沉淀对照可以包括：癌症或其他细胞系，这些细胞系具有目标蛋白的内源性或内在/非诱导表达水平，其蛋白表达可以通过蛋白质印迹、流式细胞术分析或转录分析推断;过度表达目的蛋白或目的编码基因被删除的工程细胞系;或在特定条件下处理以诱导感兴趣的蛋白质表达或信号传导事件（例如磷酸化）^{的细胞10，12}。细胞系中表征良好的蛋白质表达水平还允许通过使用一组具有高、中、低和不存在蛋白质表达的细胞系来评估测定的灵敏度。此外，工程细胞沉淀可能是兽医物种有价值的物种特异性对照，其表征或可用的组织对照可能有限¹³。虽然细胞沉淀有其局限性，例如细胞系中存在的蛋白质组有限，无法反映组织中的多样化蛋白质组，但它们可作为合适的对照，用于确认抗体可以检测目标靶标，并排除一抗、二抗或其他受体的不加选择的结合¹⁰。

诊断和研究病理学中的大多数组织固定在中性缓冲福尔马林中，在一系列醇中脱水，在二甲苯中清除，并在石蜡中加工和包埋。福尔马林固定交联蛋白质，固定和组织处理中的每一个附加步骤都可以直接影响蛋白质和抗体检测它们的能力^9，14。因此，重要的是，IHC测定中使用的任何对照都要经过相同的固定、组织处理和包埋程序。本文介绍了处理和包埋培养细胞的独特注意事项，以作为在福尔马林固定石蜡包埋组织中开发IHC测定的对照，该方法主要侧重于在组织学实验室中处理和处理细胞沉淀。

Protocol

1. 细胞沉淀制备 在四到八个150mm2 或八个x T175烧瓶中，在推荐用于细胞系的培养基和条件下将细胞生长至80%-90%汇合。例如，在Dulbecco的改良鹰培养基（DMEM）中用10%胎牛血清和2mM L-谷氨酰胺15培养293T细胞。注意：应使用感兴趣的细胞系所需的条件和培养基生长细胞16。这些条件可能因细胞系而异，但下游沉淀方法应适用于独立于培养条件的细胞系。 一旦细胞接近汇合（80%-90%），用真空移液管吸出生长培养基，并用磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗细胞。 向每个烧瓶中加入5mL的5-10mM EDTA，并将烧瓶在37°C孵育5-10分钟。轻轻敲击烧瓶的侧面以移开细胞。注意：不要使用胰蛋白酶，因为这会裂解表面表位，从而对某些抗原产生不利影响。细胞脱落后，向每个烧瓶中加入 5 mL 用于细胞系的生长培养基（例如，用于 293T 细胞的 DMEM），然后将细胞转移到 50 mL 锥形管中。 在室温下以930× g 离心锥形管5分钟。离心后，通过真空移液器抽吸除去培养基和EDTA。 在 10-20 mL 的 1x PBS 中洗涤细胞沉淀，如果使用多个板或烧瓶，则将板或烧瓶中的细胞（ 图 1 中描述的实验中大约六个 T175 烧瓶）汇集到单个 50 mL 锥形管中。 将试管以930 x g 离心5分钟。用真空移液器离心后吸出PBS。 将细胞沉淀管放在湿冰上直至固定。注意：保持细胞冷却以限制降解酶活性并最大限度地减少细胞的自溶和相关蛋白质变化，包括蛋白质定位的变化。 2. 细胞沉淀的固定 通过将 30 mL 的 10% 中性缓冲福尔马林添加到 3 mL 细胞沉淀中来执行固定，以产生 10：1（体积：vol）的固定剂与细胞的比例。 反复倒置紧密盖的 50 mL 管，直到细胞完全悬浮。注意：在完全固定之前形成缩合细胞沉淀会导致固定不均匀，导致在以后的染色和免疫标记过程中出现伪影。 让细胞悬液在室温下沉降过夜。 第二天重新倒置试管以重悬细胞，增加表面体积比以改善固定。注意：不需要也不建议涡旋细胞沉淀，因为它可能会导致细胞损伤。 3. 细胞沉淀的修剪和加工 固定24小时后，将50mL锥形管在5°C下以930× g 离心10-15分钟。确保试管盖紧，均匀分布并在离心机中平衡。注意：可以修改固定时间以反映实验室使用的组织固定时间或特定实验条件的要求。 离心后，确保细胞形成可见的沉淀。通过倾析和/或使用无菌转移移液器小心吸出来去除固定剂。 将熔融（40-60°C）羟乙基琼脂糖基凝胶（参见 材料表）以1：4（vol：vol）凝胶与细胞沉淀的比例添加到细胞沉淀中。 使用干净的 5 英寸、2 mm 尖端 Sterling 探头，用自来水冲洗眼睛，将熔融凝胶轻轻搅拌到固定细胞沉淀中，在 50 mL 锥形管底部的熔融凝胶中产生固定细胞的均匀悬浮液（图 1A）。 将带有熔融凝胶与固定细胞沉淀混合的盖盖50mL锥形管放在湿冰上5-10分钟以固化凝胶细胞沉淀。 使用干净的微型刮刀，沿着管子的侧面放置刮刀并轻轻地利用颗粒而不刺穿它，小心地从锥形管中取出颗粒。将颗粒放在活检纸上。 使用干净的微型刮刀，将细胞沉淀切成4-5毫米厚的切片，因此每片可以放入26 mm x 26 mm x 5 mm组织盒中（图1B）。 将单个凝胶颗粒切片放在一张活检纸的中心。将活检纸的两个相对端折叠在颗粒上，将其包裹起来。将包裹的颗粒放入26 mm x 26 mm x 5 mm组织盒中。关闭盖子，用组织盒盖卷曲活检包装的展开侧（图1C）。 将修剪好的细胞沉淀盒放入装有10%中性缓冲福尔马林的组织处理器蒸馏器中，并以较短的处理计划运行。注意：短处理计划包括每个蒸馏器中的30分钟，从10%中性缓冲福尔马林开始，通过一系列逐渐分级的醇脱水，在三次二甲苯变化中清除，并在两次变化中以石蜡渗透结束60°C熔融渗透/包埋石蜡（56°C熔点）。 4. 细胞沉淀的包埋 将处理好的盒放入包埋中心的保持区域。 打开组织盒盖，小心地展开活检纸。 将细胞沉淀放入一个小的 15 mm x 15 mm 一次性包埋模具中，切面朝下。注意：一个小包埋模具允许最多三个细胞沉淀切片安装在一个未染色的组织载玻片上，用于IHC测定。 同时用镊子轻轻地将细胞沉淀保持在模具底部，将62°C的组织浸润/包埋石蜡加入模具中，覆盖细胞沉淀。 将模具移动到冷块上，开始固化石蜡。在石蜡凝固时调整细胞沉淀，以将它们固定在模具底部的适当位置。 从盒中取下盖子。将暗盒自下朝下放在包埋模具的顶部，并添加额外的熔融石蜡以覆盖暗盒。 当石蜡填充在组织盒上时，将模具放回冷块中以固化17，18。 5. 细胞沉淀切片 使用切片厚度为20μm的旋转切片机修剪细胞沉淀块，直到石蜡块的整个表面和细胞沉淀被捕获在石蜡切片带中。这称为“面向”块。 冷却并将面孔块浸泡在冰浴托盘上5-15分钟，以在切片前冷却和保湿块。注意：当块水合时，细胞沉淀将在石蜡带中半透明。如果不透明，则需要更多浸泡，并且可能存在伪影。 使用旋转切片机在连续切割模式下以4μm或其他所需厚度切片细胞颗粒块的石蜡带。 将石蜡带放在设置为42°C的水浮浴上。 将使用旋转切片机制备的石蜡切片从浮选浴中拾取到带正电的载玻片上。将第一部分放在载玻片顶部的盖玻片和染色边界内，将第二部分放在其下方，将第三个细胞沉淀部分放在其下方（图1D）。 切片后，将载玻片在室温（约23°C）下干燥24小时，然后在60°C下干燥30分钟。注意：在60°C下烘烤载玻片后，细胞沉淀切片可与任何标准IHC方案一起使用，包括使用热诱导和基于酶的抗原检索的方案9。

Representative Results

加入琼脂糖基凝胶后，细胞沉淀应形成易于处理的固体凝胶状物质（图1B）。一旦嵌入，颗粒将具有类似于固体组织的稠度，并且应该相对容易在切片机上常规切片。一旦细胞沉淀被嵌入，它们就可以以与福尔马林固定、石蜡包埋组织相同的方式用于组织学和IHC实验。这包括使用热诱导表位或酶促抗原修复与间接显色检测方法（例如，使用具有辣根过氧化物酶和二氨基联苯胺检测的二抗，如图2和图3所示）使用商业IHC平台9。在组织学上，细胞应均匀分散在整个切片中，细胞聚集最少，尽管贴壁细胞可能在沉淀中维持其细胞间相互作用。这种分散体允许区分单个细胞，尽管这种区分会受到凝胶沉淀内细胞大小和相对密度的显着影响。细胞核、细胞质和细胞膜在分散时更清晰，更容易可视化（图 2）。在图2中，三个细胞系被免疫标记为TEAD转录因子。用棕色二氨基联苯胺 （DAB） 显色原观察免疫标记。细胞系具有不同水平的TEAD转录因子表达，从无表达（图2A）到弱表达（图2B），再到强表达（图2C）。在本例中，在细胞核中观察到标记，正如转录因子所预期的那样，并且在细胞质和细胞膜中不存在标记，它们是可见的，但缺乏标记（图2）。细胞沉淀可以掺入标准23 mm x 75 mm x 1 mm载玻片上的细胞沉淀微阵列（图3）。将细胞沉淀掺入微阵列中可以评估同一载玻片中具有不同表达水平的对照。在本例中，PEG10缺陷小鼠胚胎干细胞（左）作为阴性对照，过表达PEG10的293T细胞（右，棕色免疫标记）作为微阵列中的阳性对照（图3）。将包含在微阵列中的细胞沉淀的组织和包埋程序没有变化，并且可以使用类似于用于组织的方法生成微阵列19。 图 1：细胞沉淀处理。 （A） 将细胞沉淀在 50 mL 锥形管中并与凝胶混合。（B）凝固后，将颗粒连续切片以适合26 mm x 26 mm x 5 mm组织盒。（C）细胞沉淀在放入组织处理器之前用活检纸包裹。（D）在单个25 mm x 75 mm玻璃组织学载玻片上最多可以连续收集三个细胞沉淀。请点击此处查看此图的大图。 图 2：具有不同水平蛋白质或转录本表达的细胞沉淀可用于评估测定的动态范围。 细胞沉淀被免疫标记为TEAD转录因子，并显示出不同水平的TEAD表达。（A）DAUDI细胞缺乏TEAD表达，在细胞质或细胞核中没有免疫标记。蓝色染色是苏木精核的复染剂。（B）293T细胞表现出TEAD转录因子的弱核标记（棕色二氨基联苯胺（DAB）色原）。（C）底特律562细胞强烈表达TEAD如细胞核中强烈的棕色标记所示。在细胞核内标记，但未标记细胞质（棕色细胞核周围的灰白色至灰色区域），表明免疫组织化学测定的适当标记。请注意，在所有三种细胞系中，细胞都是分散的，允许可视化单个细胞，包括它们的核和细胞质形态。比例尺 = 25 μm。 请点击此处查看此图的大图。 图 3：使用具有不同蛋白表达水平的多个细胞沉淀创建的细胞沉淀微阵列允许在单个载片中同时评估对照。 PEG10缺陷小鼠胚胎干细胞（左）和过表达PEG10的293T细胞（右）被免疫标记为PEG10。虽然在过度表达PEG10的293T细胞中观察到强标记（棕色DAB显色原），但在PEG10缺陷细胞中没有明显的标记。蓝色代表苏木精复染。比例尺 = 200 μm。 请点击此处查看此图的大图。

Discussion

该协议描述了一种生成福尔马林固定，石蜡包埋细胞沉淀的方法，可用作下游免疫组织化学和 原位 杂交研究的对照。本协议中描述的组织学方法适用于多种癌症和原代细胞系，并且主要适应常规组织学技术以产生这些沉淀^17，18。当加工和嵌入时，颗粒可以以与组织类似的方式使用。这包括将它们与用于免疫组织化学实验的热诱导和酶促抗原修复方案一起使用。该协议中使用的方法的一个目的是在整个过程中保持细胞的形态和抗原性。因此，在形态和抗原性变化方面相对温和的EDTA用于分离细胞。这并不是说其他方法，例如物理破坏，是不可行的;但是，任何分离细胞的方法都应确保细胞在此过程中不会受伤。该协议的第二个目的是以类似于组织的方式固定和处理细胞，使用相同的固定剂，固定剂比例，处理计划（固定，脱水，清除和石蜡浸润）和包埋技术，因此它们可以作为下游测定的可比对照。因此，用于产生细胞沉淀的固定和处理方法应模仿用于组织的方法。

本报告中描述的方案不适用于处理具有感染因子的细胞，例如感染致病细菌或病毒的细胞，因为细胞在固定前被分离、收集和离心。研究人员可能会考虑在分离前固定细胞的方案，但这需要进一步优化以在不干扰细胞形态的情况下收集细胞。此外，感染因子细胞的固定时间和处理条件需要基于传染因子和相关机构生物安全协议的额外考虑。

福尔马林固定的石蜡包埋细胞沉淀在具有明确定义的蛋白质表达水平¹⁰方面具有独特的优势。虽然癌症和内源性细胞系提供了具有不同蛋白质表达水平的细胞选择，但基因工程技术使科学家能够通过过度表达感兴趣的蛋白质和使用CRISPR技术来切除或插入编码感兴趣的基因来模拟蛋白质表达^20，21.细胞系中过度表达蛋白质的缺点是，它们不能代表内源性蛋白质水平²²，因此它们是测定灵敏度的不良指标。相比之下，内源性细胞系和癌细胞系都可以更好地代表内源性表达水平，并且CRISPR介导的同源系中编码基因的缺失可以作为相应的阴性对照。此外，内源性细胞系或具有不同蛋白表达水平的癌细胞系是滴定实验的理想选择，以选择最终的抗体稀释液并最好地了解测定的灵敏度（图2）。围绕使用哪种细胞系的决定应基于个体实验需求，并且通常会使用多种方法的组合。

除了评估抗体是否可以检测目标蛋白外，还可以使用一组细胞系来确定抗体的特异性。例如，一组单独表达密切相关蛋白质家族的细胞系可用于测试抗体是否对单个蛋白质具有特异性，或者它是否还检测其他密切相关的蛋白质。更复杂的控制可能涉及使用通过CRISPR敲入或通过过度表达表达具有点突变的蛋白质的细胞系，这些蛋白质不能经历正在检测到的特定信号事件（例如，评估磷酸化特异性抗体时特定磷酸化位点的突变）。虽然这些是更复杂的方法，但它们可能是必要的，以确认抗体仅在特定情况下使用标记¹⁰。

重要的是要注意，细胞系的遗传操作可能不会产生同质的细胞群。例如，过表达细胞系的转染效率通常不是100%，某些细胞可能不会过度表达目标蛋白。在转染中包含可以用标准方法检测到的FLAG或相关标签有助于评估细胞系²³的转染效率。这有助于确定转染是否成功，排除由于蛋白表达而导致的检测不足，并可作为应表达目标蛋白的预期细胞比例的参考。

原位 杂交（ISH）也可以成为表征细胞沉淀中靶基因表达并为IHC方法开发提供信息的有益工具¹⁰。在筛选抗体时，了解何时可以检测到转录本以及潜在的蛋白质可以提供信息。此外，细胞沉淀ISH筛选可有益于ISH方法开发。虽然特异性在ISH测定中不太常见，但对于可应用于ISH研究的对照的开发和利用，制定适当的对照和类似的考虑因素仍然很重要。

组织微阵列是通过从供体块中取出核心并将这些核心（通常以网格模式）转移到受体石蜡块中创建的。最后，受体块在单个块中包含一系列样品，允许块中的所有样品通过相同的IHC程序，并允许在同一载玻片^24，25上直接比较多个样品。由于细胞沉淀是相对均匀的群体，因此可以用1 mm核心准确表示，使其成为包含在类似阵列中的理想候选者。使用细胞沉淀阵列，可以在一张载玻片中包括具有不同表达水平的细胞沉淀、唯一表达相关蛋白质的细胞沉淀以及表达来自不同物种的目标蛋白质的直系同源物的细胞沉淀（图3）。这允许在均匀条件下快速同时评估所有细胞沉淀，同时最大限度地减少试剂的使用²⁵。

对于该协议，建议从八个T175烧瓶中收集的最小起始细胞沉淀体积为2 mL。该体积允许生产和存档多个细胞沉淀块，因此可以在更长的时间内标准化细胞沉淀控制，并且可以从给定的沉淀创建多个细胞沉淀阵列。当处理原代患者来源的细胞系、生长缓慢的细胞系或条件限制样品体积时，可以使用较低的细胞沉淀体积。当然，较低的起始体积会增强固定和制备沉淀过程中任何细胞损失的负面影响，并将限制可用于下游工艺的材料。离心后去除固定剂时要特别小心，以尽量减少任何相关的损失。对于较小的样品体积，可以使用 1.5 mL 的带盖离心管来沉淀细胞。这些管子可以用刀片纵向平分进行处理。

与组织固定类似，该沉淀内的细胞固定对于下游IHC评估至关重要。为了实现完全固定，我们使用至少10：1的福尔马林与细胞沉淀比例并倒置锥形管以保持细胞悬浮。如果细胞在固定时未处于悬浮状态，则存在固定不完全或不充分的风险，这将影响下游免疫标记。通常，这表现为外围的强标记和颗粒中心的标记丢失或整个颗粒中不同强度的标记。

该协议使用主要由羟乙基琼脂糖组成的组织凝胶来结合细胞沉淀并使细胞均匀分布在整个细胞沉淀中。没有它，细胞就会变得紧凑并失去其细胞形态学细节。这些细胞形态学细节在抗体筛选过程中通常很重要，因为它们提供了有关抗体是否在适当的亚细胞区室（例如，细胞核、细胞质或质膜）中标记的额外信息。相反，过多的凝胶会导致沉淀内的细胞密度降低，导致细胞广泛分布，并减少每个切片的细胞数量。

该协议可以常规用于开发IHC对照。制造这些颗粒所需的材料在研究生物学和组织学实验室中很常见，并且方法简单易用。虽然细胞沉淀作为IHC对照具有局限性，但它们是初始抗体筛选和补充其他组织对照的绝佳工具。

Materials

10% Neutral Buffered Formalin	VWR	16004-128
50 mL Conical Tube	Becton Dickinson Labware	#0747-1886
70% Ethanol	Koptec	V1401
95% Ethanol	Koptec	V1101
Biopsy Wraps	Surgipath Medical Industries, Inc	#01090
Costar Stripette serological pipette 10mL	Corning	CLS4101
Flex 100	Epredia	8101
Flex 95	Epredia	8201
Histogel	Thermo Scientific	#R904012
Leica Automated Rotary Microtome	Leica	RM2255
Micro Spatula, rounded and tapered ends	Tedd Pella	#13510
NanoZoomer 2.0 HT whole slide imager	Hamamatsu
Paraplast Tissue Infiltration/Embedding Paraffin	Surgipath	39601006
Pipette Controller	CAPP	PA-100
Reagent Alcohol	Epredia	9111
Sterling Probe 5” 2mm Tip with Eye	Roboz Surgical Instrument Co., Inc	#RS-9522
Superfrost Plus positively charged microscope slides	Thermo Scientific	6776214
Tissue cassettes; PrintMate Slotted Cassette	Epredia	B851120WH
TMA Tissue Grand Master	3DHistech LTD
Xylenes	VWR	89370-088