הכנת תרחיף תאים שאינו קרדיומיוציטים לריצוף RNA חד-תאי מלב עכבר בוגר לאחר אוטם שריר הלב
Summary
כאן, אנו מתארים פרוטוקול לבידוד כמות מספקת של לא-קרדיומיוציטים בודדים עם כדאיות גבוהה מלב עכבר לאחר אוטם שריר הלב (MI). זה יכול לשמש לריצוף תא בודד לאחר מכן, ניתוח ציטומטריית זרימה, ותרבית תאים ראשונית.
Abstract
אוטם שריר הלב (MI) היא אחת ממחלות הלב וכלי הדם הנפוצות ביותר, עם תמותה גוברת ברחבי העולם. לא-קרדיומיוציטים מהווים יותר ממחצית מכלל אוכלוסיית תאי הלב, והם תורמים לפיצויים אדפטיביים על פגיעה בשריר הלב, כולל תגובות דלקתיות, תיקון רקמות והיווצרות צלקות. כדי לחקור את המיקרו-סביבה הלבבית שלאחר MI, ריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq) נמצא בשימוש נרחב לזיהוי סוגים שונים של תאי לב ותקשורת בין-תאית. בין ההליכים של הכנת דגימת scRNA-seq, הכנת תרחיף התא הוא אחד השלבים הקריטיים ביותר, מכיוון שיכולת הקיום של התא יכולה להשפיע על איכות תוצאות scRNA-seq. לכן, תכננו פרוטוקול ניסיוני להכנת תרחיף תאים שאינו קרדיומיוציטים מלבבות עכברים לאחר MI עם דגש נוסף על שיפור יכולת הקיום של התא על ידי בחירת אנזימי עיכול עדינים, שליטה בזמן העיכול ויישום מיון תאים המופעל על ידי פלואורסצנטיות (FACS). לבסוף, בודדנו תאי CD45+ מתרחיף התאים שאינו קרדיומיוציטים המתקבל באמצעות פרוטוקול זה, ולאחר מכן ביצענו scRNA-seq.
Introduction
אוטם שריר הלב (MI) היא אחת ממחלות הלב וכלי הדם הנפוצות ביותר, ותמותה עולה ברחבי העולם1. MI נגרמת על ידי אספקת דם לא מספקת לשריר הלב שמסביב, אשר יכול להיות תוצאה של חסימת עורקים כליליים המתרחשת עם קרע רובד טרשתי. למרות שהתערבות כלילית מלעורית (PCI) הפחיתה את שיעורי התמותה של חולי MI חריפים, השכיחות הגבוהה של אי ספיקת לב לאחר MI נותרה בעיה2. הפתופיזיולוגיה העיקרית העומדת בבסיס אי ספיקת לב לאחר MI היא תגובת הפיצוי של הגוף לפגיעות לב, הכוללת החלפת שריר הלב המת בצלקות פיברוטיות שאינן מתכווצות. תגובות אדפטיביות אלה מסתמכות באופן משמעותי על דלקת מקומית המתווכת על ידי אינטראקציות בין סוגי תאים מרובים ותאי רקמת לב, ודלקת זו נחשבת כיום כיעד טיפולי פוטנציאלי להפחתת היווצרות צלקות פיברוטיות, ובכך להגן מפני אי ספיקת לב שלאחר MI 3,4. באופן מעניין, המיקרו-סביבה באתר אוטם חווה מעבר תלוי זמן בסוגי התאים החודרים ובתפקודים בשלבים שונים של MI 1,5. מחקרים רבים הראו כי לא-קרדיומיוציטים (למשל, תאי מערכת החיסון, פיברובלסטים ותאי אנדותל) ממלאים תפקידים מרכזיים בדלקת שלאחר MI ובתיקון רקמות 5,6. בשנים האחרונות, ריצוף חד-תאי נמצא בשימוש נרחב ככלי רב עוצמה להבהרת המעורבות והתפקודים של לא-קרדיומיוציטים במיקרו-סביבה 7,8 שלאחר MI. זה מספק תובנות לגבי הפתופיזיולוגיה של פציעה ותיקון לאחר MI ופיתוח טיפולים פוטנציאליים נגד אי ספיקת לב לאחר MI.
ריצוף RNA בתפוקה גבוהה (RNA-Seq) היא טכניקה המשמשת לחקר תעתיקים שלמים בפירוט רב באמצעות ריצוף הדור הבא (NGS)7,8,9. לאחרונה, הפיתוח של scRNA-Seq חולל מהפכה בתחום המחקר הביו-רפואי. בהשוואה לריצוף קונבנציונלי בתפזורת, scRNA-Seq מנתח פרופילי ביטוי גנים והטרוגניות שעתוק ברמת התא הבודד 7,8. טכניקה זו מקדמת באופן משמעותי את המחקר של הפתופיזיולוגיה התאית של MI 9,10 על ידי זיהוי סוגי תאים שונים במחזור הדם במיקרו-סביבה שלאחר MI וחשיפת האינטראקציה בין קרדיומיוציטים ושאינם קרדיומיוציטים. ממצאים אלה תורמים עוד יותר לחשיפת מטרות טיפוליות חדשות לאי ספיקת לב לאחר MI. באופן כללי, ניסוי הפוסט-MI מבוסס scRNA-seq כולל שלושה חלקים עיקריים: (1) ביסוס מודל בעלי חיים פוסט-MI; (2) הכנת השעיית התא; ו-(3) ריצוף מדגם וניתוח נתונים. באופן בולט, הכנת תרחיף התא היא השלב הקריטי ביותר בהכנת ניסוי scRNA-Seq מכיוון שאיכות תרחיף התא קובעת את דיוק התוצאות.
פרוטוקול זה נועד לחלץ תרחיף תאים שאינו קרדיומיוציטים מרקמת הלב שלאחר MI; באופן משמעותי, הפרטים הספציפיים לשמירה על כדאיות התא ורזולוציה נכללים. בינתיים, את הציוד המשמש בפרוטוקול זה, כגון ערכות ניתוח לעכברים, מנשמי מכרסמים וצנטריפוגות, ניתן למצוא ברוב מרכזי הניסויים בבעלי חיים ובמעבדות ביו-רפואיות, ולכן עלות הניסוי של פרוטוקול זה נמוכה יחסית. יתר על כן, אם לוקחים בחשבון נקודות זמן ואתרים של אוטם כמשתנים, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם כדי לדמות מגוון רחב של תרחישים קליניים, במיוחד עבור סיבוכים לאחר MI.
Protocol
Representative Results
Discussion
מאמר זה נועד לתאר פרוטוקול לבידוד יחיד שאינו קרדיומיוציטים מלבבות עכברים לאחר MI. ניתן ליישם את הפרוטוקול כדי לבודד סוגים שונים של תאים במיקרו-סביבה שלאחר MI באיכות גבוהה, כולל תאי מערכת החיסון, תאי אנדותל ופיברובלסטים. שלושה גורמים חיוניים חיוניים להשגת תרחיף תאים איכותי לריצוף תא יחיד. הר…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מדעי הטבע של פרובינציית ג’ג’יאנג (LQ22H020010).
Materials
| Acridine Orange / Propidium Iodide Stain | Logos biosystems | F23001 | |
| Automated Cell Counter | Logos biosystems | L20001 | |
| Bovine Serum Albumin | Servicebio | G5001 | Cytoprotective effect |
| Cell Counting Slides | Logos biosystems | L12001 | |
| Collagenase Type IV | Gibco | 17104019 | Digestive enzymes |
| Dispase II | Sigma | D4693 | Digestive enzymes |
| Dnase I | Roche | 11284932001 | Prevent cell clumping |
| Falcon 40μm Cell Strainer | Falcon | 352340 | Remove cell clumps |
| Falcon 70μm Cell Strainer | Falcon | 352350 | Remove undigested tissue and clumps |
| Flow Cell Sorter | Beckman Coulter | B25982 | |
| Iodophor | OU QING SI | 10054963976859 | |
| Needle Holder | FST | 12061-01 | |
| Ophthalmic Forceps | RWD | F14012-10 | |
| Ophthalmic Scissors | RWD | S11036-08 | |
| Phosphate Buffered Saline | Servicebio | G4202-500ML | |
| RBC Lysis Buffer | Beyotime | C3702-120ml | Remove red blood cells |
| Rib Retractor | FST | 17005-04 | |
| Rodent Ventilator | Harvard | 730043 | |
| RPMI 1640 Medium | Gibco | 11875093 | Solvent solution of enzyme |
| Sterile Scissor | RWD | S14014-10 |
References
- Reed, G. W., Rossi, J. E., Cannon, C. P. Acute myocardial infarction. Lancet. 389 (10065), 197-210 (2017).
- Gu, J., et al. Incident heart failure in patients with coronary artery disease undergoing percutaneous coronary intervention. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 8, 727727 (2021).
- Frangogiannis, N. G. The inflammatory response in myocardial injury, repair, and remodelling. Nature Reviews. Cardiology. 11 (5), 255-265 (2014).
- Kain, V., Prabhu, S. D., Halade, G. V. Inflammation revisited: Inflammation versus resolution of inflammation following myocardial infarction. Basic Research in Cardiology. 109 (6), 444 (2014).
- Tzahor, E., Dimmeler, S. A coalition to heal-the impact of the cardiac microenvironment. Science. 377 (6610), 4443 (2022).
- Song, K., et al. Heart repair by reprogramming non-myocytes with cardiac transcription factors. Nature. 485 (7400), 599-604 (2012).
- Jaitin, D. A., et al. Massively parallel single-cell RNA-seq for marker-free decomposition of tissues into cell types. Science. 343 (6172), 776-779 (2014).
- Massaia, A., et al. Single cell gene expression to understand the dynamic architecture of the heart. Frontiers in Cardiovascular Medicine. 5, 167 (2018).
- Papalexi, E., Satija, R. Single-cell RNA sequencing to explore immune cell heterogeneity. Nature Reviews. Immunology. 18 (1), 35-45 (2018).
- Jin, K., et al. Single-cell RNA sequencing reveals the temporal diversity and dynamics of cardiac immunity after myocardial infarction. Small Methods. 6 (3), 2100752 (2022).
- Tombor, L. S., et al. Single cell sequencing reveals endothelial plasticity with transient mesenchymal activation after myocardial infarction. Nature Communications. 12 (1), 681 (2021).
- Virag, J. A., Lust, R. M. Coronary artery ligation and intramyocardial injection in a murine model of infarction. Journal of Visualized Experiments. (52), e2581 (2011).
- Reichard, A., Asosingh, K. Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry. Cytometry Part A. 95 (2), 219-226 (2018).
- Gladka, M. M., et al. Single-cell sequencing of the healthy and diseased heart reveals cytoskeleton-associated protein 4 as a new modulator of fibroblasts activation. Circulation. 138 (2), 166-180 (2018).
- Garcia-Flores, V., et al. Preparation of single-cell suspensions from the human placenta. Nature Protocols. , (2022).
- Guez-Barber, D., et al. FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain. Journal of Neuroscience Methods. 203 (1), 10-18 (2012).
- Rheinländera, A., Schravenab, B., Bommhardt, U. CD45 in human physiology and clinical medicine. Immunology Letters. 196, 22-32 (2018).
- Hua, X., et al. Single-cell RNA sequencing to dissect the immunological network of autoimmune myocarditis. Circulation. 142 (4), 384-400 (2020).
- Grindberg, R. V., et al. RNA-sequencing from single nuclei. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (49), 19802-19807 (2013).
- Vanden Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14, 935-936 (2017).
