Экспресс-оценка качества мембранного белка методом флуоресцентной эксклюзионной хроматографии

Summary

В настоящем протоколе описывается процедура проведения флуоресцентной эксклюзионной хроматографии (ФСЭС) мембранных белков для оценки их качества для последующего функционального и структурного анализа. Представлены репрезентативные результаты FSEC, собранные для нескольких рецепторов, связанных с G-белком (GPCR), в условиях, солюбилизированных моющими средствами и без детергентов.

Abstract

Во время выяснения структуры мембранного белка и биофизической характеристики обычно тестируются многочисленные белковые конструкции, содержащие различные метки, усечения, делеции, вставки партнеров по слиянию и стабилизирующие мутации, чтобы найти ту, которая не агрегируется после экстракции из мембраны. Кроме того, важной практикой является буферный скрининг для определения детергента, добавки, лиганда или полимера, которые обеспечивают наиболее стабилизирующие условия для мембранного белка. Ранняя характеристика качества мембранного белка с помощью флуоресцентной эксклюзионной хроматографии обеспечивает мощный инструмент для оценки и ранжирования различных конструкций или условий без необходимости очистки белка, и этот инструмент также сводит к минимуму потребность в образце. Мембранные белки должны быть флуоресцентно помечены, обычно путем экспрессии их с помощью метки GFP или аналогичной. Белок может быть солюбилизирован непосредственно из целых клеток, а затем грубо осветлен центрифугированием; Затем белок передается по колонке исключения размера, и собирается флуоресцентный след. Здесь представлен метод проведения FSEC и репрезентативные данные FSEC по мишеням GPCR сфингозин-1-фосфатный рецептор (S1PR₁) и серотониновый рецептор (5HT_2AR).

Introduction

Эксклюзионная хроматография (SEC), также известная как гель-фильтрационная хроматография, обычно используется в науке о белках¹. Во время SEC белки разделяются на основе их гидродинамического радиуса, который является функцией размера и формы белка². Короче говоря, это разделение достигается путем нанесения образцов белка под потоком на упакованный слой пористых шариков, которые действуют как молекулярное сито. Используемые шарики часто представляют собой сшитую агарозу с определенным диапазоном размеров пор, что позволяет белкам либо входить, либо исключаться из пор шариков ^3,4,5,6,7. Белки с меньшими гидродинамическими радиусами проводят большую часть времени в порах и, таким образом, проходят через упакованный слой с меньшей скоростью, тогда как более крупные белки проводят большую часть времени вне шариков (исключенный объем) и перемещаются через упакованный слой с большей скоростью. SEC можно использовать в качестве этапа очистки белка, когда используется препаративная колонка¹. При использовании аналитической колонки SEC можно использовать для анализа качества и свойств белка². Например, белковые агрегаты, которые могут присутствовать в образце и указывать на белок низкого качества, как правило, очень большие, то есть они перемещаются только в исключенном объеме и, таким образом, вымываются из колонки в самой ранней точке; Этот том называется пустотой столбца или пустотой. Кроме того, стандарты молекулярной массы могут быть использованы для калибровки колонки, что позволяет интерполировать расчетную молекулярную массу интересующего белка из стандартной кривой.

Как правило, поглощение белка на длине волны 280 нм используется для мониторинга элюирования белка из колонки исключения размера. Это ограничивает использование SEC в качестве инструмента анализа до тех пор, пока интересующий белок не будет в значительной степени свободен от загрязняющих белков, например, на последнем этапе очистки белка. Тем не менее, флуоресцентный SEC (FSEC) использует интересующий белок, который флуоресцентно мечен. Следовательно, флуоресцентный сигнал может быть использован для специфического мониторинга элюирования интересующего белка в присутствии других белков или даже сырых смесей ^8,9. Кроме того, поскольку флуоресцентные сигналы обладают высокой чувствительностью, успешный анализ может быть выполнен на образцах с чрезвычайно низким содержанием белка. Интересующий белок часто флуоресцентно мечен путем включения зеленого флуоресцентного белка (GFP) или усиленной метки GFP (eGFP) в конструкцию экспрессии. Затем флуоресцентный сигнал можно контролировать путем возбуждения на длине волны 395 нм или 488 нм и детектирования флуоресцентного излучения на длине волны 509 нм или 507 нм для GFP или eGFP соответственно¹⁰.

Преимущество использования флуоресцентного сигнала для мониторинга элюирования белка из колонки SEC делает FSEC ценным инструментом для анализа образцов мембранного белка, когда уровни экспрессии особенно низки по сравнению с растворимыми белками. Важно отметить, что качество и свойства мембранных белков могут быть проанализированы непосредственно после солюбилизации из сырых лизатов без необходимости сначала оптимизировать процесс очистки^11,12. По этим причинам FSEC можно использовать для быстрого анализа качества мембранного белка при изучении различных факторов, которые могут потребоваться для улучшения поведения мембранного белка в растворе. Например, обычно тестируют многочисленные конструкции, содержащие различные метки, усечения, делеции, вставки партнеров по слиянию и стабилизирующие мутации, чтобы найти ту, которая не агрегируется после экстракции из мембраны^13,14. Кроме того, буферный скрининг для определения детергента, добавки, лиганда или полимера, которые обеспечивают наиболее стабилизирующие условия для мембранного белка, может определить наилучшую буферную композицию для очистки белка или для обеспечения стабильности для последующих применений, таких как биофизические анализы или структурные характеристики.

Таким образом, общая цель метода FSEC состоит в том, чтобы собрать профиль элюирования колонки SEC для интересующего мембранного белка-мишени. Кроме того, поскольку используется флуоресценция, этот след SEC собирается на самой ранней стадии оптимизации конструкций и условий перед любой длительной очисткой. Трассировка FSEC может быть использована в качестве сравнительного инструмента для оценки вероятности успеха очистки мембранного белка с различными буферными условиями или конструкциями мембранных белков. Таким образом, сбор профилей FSEC может быть использован в качестве быстрого итеративного процесса для достижения оптимального дизайна конструкции и состава буфера, прежде чем тратить усилия на создание количеств чистого белка, необходимых для других методов анализа.

Protocol

1. Моющее средство и подготовка буфера для FSEC Приготовьте моющий стоковый раствор.Чтобы приготовить исходный раствор объемом 20 мл, взвесьте 4 г порошка додецилмальтозида (DDM) и 0,4 г порошка гемисукцината холестерина (CHS) и доведите его до 20 мл с лабораторной дистилляцией H2O. После добавления всех компонентов смешайте со сквозной инверсией при 4 ° C до полного растворения компонентов. Рекомендуется ночное сквозное смешивание при температуре 4 °C. Исследуйте и храните моющие средства при температуре -20 °C до использования. Если бульон необходимо использовать немедленно, храните его на льду.ПРИМЕЧАНИЕ: Стандартное моющее средство, используемое в этой работе, представляло собой смесь 20% (мас./об.) DDM и 2% (мас./об.) CHS (см. Таблицу материалов). Можно использовать различные моющие средства (например, лаурилмальтозу, неопентилгликоль; LMNG) или использование экстракции без моющих средств с полимерами, такими как стирол-малеиновая кислота (SMA), может быть протестировано. Это необходимо решить при проектировании экспериментальных условий, подлежащих испытанию. Подготовьте буфер для солюбилизации.Приготовьте буфер для солюбилизации, комбинируя правильный вес или объем компонентов, чтобы достичь конечной концентрации 100 мМ HEPES, 200 мМ NaCl, 20% (об./об.) глицерина и 1x коктейля ингибитора протеазы (см. Таблицу материалов) в стакане.ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании приготовления 50 мл буфера солюбилизации было достаточно для обработки пяти образцов. Добавьте в стакан 0,7 объема (например, 35 мл при приготовлении 50 мл буфера) лабораторной дистилляции H2O. Смешайте на магнитной мешалке и с помощью рН-метра отрегулируйте рН буфера до 7,5 путем капельного добавления концентрированного NaOH. Используя мерный цилиндр, долейте буфер до конечного необходимого объема лабораторной дистилляцией H2O. Подготовьте рабочий буфер SEC.Подготовьте проточный буфер SEC, объединив правильный вес или объем компонентов, чтобы достичь конечной концентрации 100 мМ HEPES, 150 мМ NaCl и 10% (об./об.) глицерина в стакане.ПРИМЕЧАНИЕ: В настоящем исследовании приготовления 600 мл буфера SEC было достаточно для запуска пяти образцов. Добавьте в стакан 0,7 объема (например, 420 мл при приготовлении 600 мл буфера) лабораторной дистилляции H2O. Смешайте на магнитной мешалке и с помощью рН-метра отрегулируйте рН буфера до 7,5 путем капельного добавления концентрированного NaOH. Используя мерный цилиндр, долейте буфер до конечного необходимого объема лабораторной дистилляцией H2O. Отфильтруйте буфер SEC через пористый фильтр размером 0,45 мкм с бутылочной крышкой под вакуумом (см. Таблицу материалов). После того, как буфер прошел через фильтр, дегазируйте его, оставляя под вакуумом до тех пор, пока при встряхивании не исчезнут пузырьки. Добавьте конечную концентрацию 0,03% (мас./об.) DDM и 0,003% (мас./об.) CHS в буфер SEC, добавив требуемый объем моющего средства, приготовленного на этапе 1 (например, 0,9 мл при изготовлении 600 мл буфера SEC). Предварительно охладите буфер перед использованием.ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от тестируемых условий можно использовать различные буферы. Например, при тестировании влияния различных детергентов на интересующий белок в идеале необходимо сделать буфер с тем же детергентом, что и тот, который используется для солюбилизации белка. При тестировании условий без моющих средств с помощью SMA моющее средство следует полностью исключить из буфера SEC. Тем не менее, см. раздел обсуждения для получения более подробной информации об изменениях протокола для скрининга моющих средств. 2. Пробоподготовка для FSEC Подготовьте клеточные гранулы.ПРИМЕЧАНИЕ: Отправной точкой для анализа является сбор клеточной гранулы из культуры экспрессии суспензионных клеток GFP-меченного (или другого флуоресцентно меченого) белка, представляющего интерес. Точные сроки и условия сбора урожая будут зависеть от экспрессируемого белка, используемой клеточной линии, условий, в которых были выращены клетки, и метода, с помощью которого была индуцирована экспрессия белка. Эти детали выходят за рамки данного протокола. В этом исследовании использовали 0,5-1 г клеточной гранулы Sf21 для каждого тестируемого состояния, что соответствовало 25-50 мл культуры через 2-3 дня после заражения примерно 4 x 106 жизнеспособными клетками / мл разведения бакуловируса P2 в соотношении 1:20. Обратите внимание, что описанный здесь протокол был протестирован и обнаружил, что он одинаково хорошо работает с аналогичными влажными весами клеточных гранул из других линий эукариотических клеток (например, HEK293E).Когда клетки из суспензионных культур будут готовы к сбору, перенесите 25-50 мл аликвот культуры в конические пробирки объемом 50 мл. Уравновесьте пробирки и используйте настольную центрифугу в поворотном ведре (см. Таблицу материалов) при 2,000 x g в течение 15 минут при комнатной температуре для гранулирования ячеек. Удалите и выбросьте надосадочную жидкость культуры, осторожно опрокинув ее, или используйте пипетку объемом 50 мл с наполнителем для пипеток, если гранула клетки особенно рыхлая. Если клетки будут использоваться сразу для анализа, поместите гранулы клетки на лед и приступайте непосредственно к шагу 5. Если ячейки должны быть сохранены для использования на более позднем этапе, заморозьте клетки, поместив их при -80 ° C. Если гранулы ячейки хранились при температуре -80 °C, быстро разморозьте их, инкубируя при комнатной температуре в течение 15 минут или до тех пор, пока образец не перестанет быть замороженным. Немедленно переместите образец на лед, выполнив этот шаг. Ресуспендировать и солюбилизировать образец.Добавьте 2 мл буфера солюбилизации (этап 1.2) в клеточную гранулу. Инкубировать со сквозной инверсией при 4 °C в течение 15-30 мин до однородной массы. Добавьте предварительно смешанный моющий состав (этап 1.1) (например, 100 мкл 20% DDM/2% CHS) для получения конечной концентрации 1% DDM/0,1% CHS. Солюбилизируйте в течение 30 мин с инверсией из конца в конец при 4 °C.ПРИМЕЧАНИЕ: При желании можно параллельно протестировать несколько условий. Количество параллельных выборок, которые могут быть обработаны одновременно, будет зависеть от доступной системы для запуска эксперимента SEC. В описанной здесь установке можно было обрабатывать до пяти образцов одновременно. Выполните этап низкоскоростного центрифугирования.Центрифугируйте образец в предварительно охлажденной (4 °C) настольной центрифуге в откидном ведре при 2 000 x g в течение 15 минут. Выполните этап высокоскоростного центрифугирования.Осторожно перенесите надосадочную жидкость из низкоскоростного центрифугирования в ультрацентрифугирующие пробирки (например, пробирки 0,5-2 мл) с помощью иглы с тупым концом, прикрепленной к шприцу объемом 5 мл, стараясь не нарушить гранулу при низкоскоростном отжиме. Сбалансируйте пары пробирок с точностью до 0,05 г и поместите их в ротор ультрацентрифугирования с фиксированным углом (см. Таблицу материалов). Центрифуга при 4 °C в течение 30 мин при 250 000 x g. 3. Эксклюзионная хроматография (SEC) Подготовьте систему жидкостной хроматографии быстрых белков (FPLC) и уравновесьте колонку.Подготовьте систему, следуя инструкциям производителя (см. Таблицу материалов), например, заполнив систему буфером SEC и продув насосы воздухом. Подключите колонку SEC к FPLC, чтобы воздух не попадал в колонну. Это достигается путем приложения противодавления к колонне SEC с помощью шприца, наполненного водой (прикрепленного к нижней части колонны), чтобы выполнить каплевидное соединение с траекторией потока системы FPLC. Предварительно уравновесьте колонну SEC, промыв ее сначала в объемах 1,5 колонки (36 мл для колонки 24 мл) лабораторной дистиллированной и отфильтрованной H2O, а затем 1,5 объема буфера SEC в колонне при рекомендуемом расходе и давлении для колонны (см. Таблицу материалов).ПРИМЕЧАНИЕ: Система FPLC, используемая в этом исследовании для выполнения FSEC, находилась в холодной среде и имела пятипозиционный петлевой клапан и шестипозиционный пластинчатый коллектор фракции. Эта настройка позволяет загружать пять образцов и последовательно выполнять их в одном и том же столбце в автоматическом режиме, не требуя ручного вмешательства между прогонами. Для проведения экспериментов SEC использовалась коммерчески доступная предварительно упакованная колонка объемом 24 мл (см. Таблицу материалов), которая содержала смолу, позволяющую разрешать белки в диапазоне молекулярной массы 10-600 кДа. Если интересующий белок особенно велик, вместо него можно использовать альтернативную матрицу колонки, позволяющую разделять белки с молекулярной массой до 5000 кДа. Обратите внимание, что присутствие детергента/липидной мицеллы увеличит общий размер мембранного белка на >150 кДа, в зависимости от используемого белка и моющего средства. Примените образец к столбцу и запустите эксперимент SEC.Перенесите надосадочную жидкость со стадии высокоскоростного центрифугирования в шприц объемом 1 мл с помощью иглы с тупым концом, прикрепленной к шприцу. Это позволяет извлекать пробы из центрифужной пробирки, не нарушая гранулы. Установите цикл выборки на загрузку. Переполните петлю образца объемом 500 мкл, впрыснув 600-700 мкл образца из шприца в загрузочное отверстие. В зависимости от используемой системы этот этап загрузки может быть запрограммирован в методе, чтобы гарантировать отсутствие ошибок. Во время метода впрыскивают пробу из контура в колонну, опорожняя ее 4 мл буфера SEC при рекомендуемом расходе и давлении для колонны (см. Таблицу материалов). Запускайте колонку с той же скоростью потока, пока не пройдет 1,5 объема колонки (36 мл для колонки 24 мл) буфера. При 0,25 объема колонки (6 мл для колонки 24 мл) начните собирать фракции 0,2 мл, чтобы собрать 90 фракций.ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку объем пустоты колонны, как ожидается, составит 0,3 объема колонки, начало сбора фракций непосредственно перед этим гарантирует, что элюирование всего белка контролируется, включая любой белок, присутствующий в объеме пустоты. 4. Сбор и анализ флуоресцентных следов Перенесите образцы из коллектора фракций (этап 3.2.5) на 96-луночную пластину и считайте флуоресцентный сигнал.Перед снятием флуоресцентных показаний разведите собранные образцы. С помощью многоканальной пипетки передайте 90 мкл лабораторной дистилляции H2O из резервуара в каждую лунку непрозрачной 96-луночной пластины с плоским дном (см. Таблицу материалов). Если фракции были собраны в 96-луночный блок на этапе 3.2.5, используйте многоканальную пипетку для переноса 10 мкл фракций SEC из блока в непрозрачную 96-луночную пластину с плоским дном и перемешайте пипеткой вверх и вниз. В противном случае, если фракции SEC были собраны в отдельные пробирки на этапе 3.2.5, перенесите 10 мкл каждой фракции на непрозрачную 96-луночную пластину с плоским дном одну за другой, каждый раз пипетируя вверх и вниз для смешивания образцов. Поместите непрозрачную пластину с плоским дном на 96 лунок в считыватель пластин и измерьте флуоресценцию. Если GFP является флуоресцентной меткой (используется здесь), установите возбуждение как можно ближе к 488 нм и обнаруживайте флуоресцентное излучение как можно ближе к 507 нм.ПРИМЕЧАНИЕ: Разбавление, необходимое перед измерением флуоресценции, будет зависеть от общего количества интересующего белка, присутствующего в культуре экспрессии, и чувствительности используемого планшетного считывателя. В примерах, показанных в этом исследовании, образцы были разбавлены водой в 10 раз. В качестве отправной точки фракции должны быть разбавлены в 5-10 раз в воде или буфере перед обнаружением. Если зарегистрированный следовой сигнал FSEC особенно низкий, вместо него можно использовать меньшие разведения или даже неразбавленный образец. Устройство, используемое для обнаружения в этом исследовании, представляло собой считыватель пластин, способный возбуждать при 488 нм и детектировать флуоресцентное излучение при 507 нм (см. Таблицу материалов). Построение трассировок FSEC.Экспортируйте данные из устройства чтения пластин в необработанном формате (необработанный текст или файл значений, разделенных запятыми). Эти необработанные данные будут нанесены на ось Y трассировки FSEC. Для оси X рассчитайте объем, при котором была собрана каждая фракция. Первая скважина должна быть объемом элюирования, при котором была собрана первая фракция, чтобы учесть задержку фракционирования (6 мл в этом примере). Фракции после этого должны последовательно увеличиваться на объем собранной фракции (0,2 мл в этом примере). После того, как данные по осям X и Y были рассчитаны, скопируйте и вставьте данные в программное обеспечение для построения графиков (см. Таблицу материалов), чтобы построить график флуоресцентного сигнала в каждой скважине в зависимости от объема, при котором он вымывался из столбца.ПРИМЕЧАНИЕ: На рисунке 1 показано схематическое изображение шагов, необходимых для запуска эксперимента FSEC. Проанализируйте трассировки FSEC.Оцените количество элюирования белка в объеме пустоты (приблизительно 8 мл для колонки объемом 24 мл), что указывает на то, что белок очень большой по размеру и, вероятно, развернут/агрегирован. Оцените количество белка, выделяемого в любых более поздних пиках, которые указывают на свернутый белок. Ожидается, что это будет от 10 мл до 16 мл для колонки объемом 24 мл в зависимости от размера белка (при сочетании с детергентом/липидной мицеллой). Обратите пристальное внимание на форму пика, особенно если это широкий или расщепленный пик, охватывающий более 3-4 мл (для столбца объемом 24 мл), так как это указывает на полидисперсный образец. Рассчитайте соотношение между высотой мономерного пика и высотой пика пустоты, разделив максимальный сигнал, зарегистрированный в пике мономера, на максимальный сигнал в пике пустоты.ПРИМЕЧАНИЕ: Это значение представляет собой индекс монодисперсности и позволяет количественно измерить качество белка; Более крупные значения указывают на наилучшее возможное качество, тогда как значения ниже 1 указывают на проблемные образцы, поскольку в них больше агрегированного белка, чем свернутого белка. Если необходимо сравнить несколько прогонов FSEC и наиболее важной характеристикой является количество мономера в каждом случае, постройте трассы как необработанный сигнал, записанный считывателем пластин (например, RFU).ПРИМЕЧАНИЕ: Если сравнение количества мономера по сравнению с развернутым белком является более важным, сигнал должен быть нормализован до процента от общего сигнала с использованием минимальных и максимальных показаний в трассе, что усилит различия в соотношении между агрегированным и мономерным белком между следами. Рисунок 1: Схематическое изображение шагов, необходимых для проведения эксперимента FSEC. (1) Клетки, экспрессирующие интересующий флуоресцентно меченный белок, солюбилизируются. (2) Сырая солюбилизация сначала осветляется низкоскоростным вращением, а затем (3) высокоскоростным вращением. (4) Надосадочная жидкость осветленного образца загружается и запускается на соответствующей колонне SEC, и (5) фракции собираются. (6) Образцы фракций переносятся на 96-луночный планшет, и с помощью считывателя пластин обнаруживается флуоресцентный сигнал GFP для (7) построения трассы FSEC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Representative Results

Во-первых, были исследованы динамический диапазон и нижние пределы обнаружения eGFP для планшетного считывателя, используемого в этом исследовании. Очищенный стандарт eGFP известной концентрации разбавляли в конечном объеме 50 мкл до 50 нг·мкл-1, 25 нг·мкл-1, 12,5 нг·мкл-1, 6,25 нг·мкл-1, 3,125 нг·мкл-1, 1,5625 нг·мкл-1, 0,78125 нг·мкл-1 и 0,390625 нг·мкл-1, и флуоресценцию считывали с использованием возбуждения 488 нм и излучения 507 нм (рис. 2 ). Этот эксперимент показал, что планшетный считыватель имел нижний предел обнаружения 30 нг белка, меченного eGFP, на лунку и динамический диапазон до 500 нг белка, меченного eGFP, на лунку до насыщения сигнала. Используя значение нижнего предела и предполагая, что элюирование белка ограничено 0,33 объема колонки, для загрузки колонки требуется всего 1,28 мкг белка, меченного eGFP, для загрузки колонки SEC, чтобы можно было наблюдать обнаруживаемый сигнал FSEC. Рисунок 2: Стандартная кривая eGFP. Диаграмма рассеяния флуоресцентного сигнала для очищенного стандарта eGFP, разбавленного до 50 нг·мкл−1, 25 нг·мкл−1, 12,5 нг·мкл−1, 6,25 нг·мкл−1, 3,125 нг·мкл−1, 1,5625 нг·мкл−1, 0,78125 и 0,390625 нг·мкл−1. (A) Отображаются все разбавления, в том числе с насыщенным сигналом. (B) Увеличенная точечная диаграмма, включающая только стандарты, попадающие в динамический диапазон считывателя пластин. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Во-вторых, колонка объемом 24 мл, используемая для этого исследования, была откалибрована в соответствии со стандартами молекулярной массы. Используя те же буферные и рабочие условия, которые использовались для анализа FSEC, стандарты молекулярной массы синего декстрана (>2000 кДа), ферритина (440 кДа), альдолазы (158 кДа), кональбумина (75 кДа) и овальбумина (43 кДа) вводили индивидуально и пропускали через колонку, а следы элюирования собирали при поглощении 280 нм. Зарегистрированные объемы элюирования составляли 8,9 мл, 12,4 мл, 15,2 мл, 16,9 мл и 18 мл соответственно. Когда эти объемы элюирования были преобразованы в Kav (уравнение 1) и построены на графике относительно логарифмических молекулярных масс, можно было подогнать стандартную кривую. Это позволило оценить молекулярную массу GPCR, протестированных в этом исследовании, путем интерполяции стандартной кривой (рис. 3). Например, след FSEC серотонинового рецептора GPCR 2A (5HT2AR) после солюбилизации в детергенте DDM указывал на объем элюирования 13,4 мл. Этот объем элюирования 5HT2AR находится между объемами элюирования, зарегистрированными для ферритина и альдолазы, и обеспечивает расчетную молекулярную массу примерно 300 кДа. Конструкция 5HT 2A R, используемая в этом исследовании, составляет приблизительно 50 кДа (включая метку eGFP), что означает, что если предположить, что 5HT2AR является мономерным, молекулярная масса 250 кДа может быть отнесена к детергенту/липидной мицелле DDM. Уравнение для преобразования объемов элюирования выглядит следующим образом (уравнение 1): (Уравнение 1) где V e — объем элюирования, V 0 — объем пустот столбца, V c — общий объем столбца. Рисунок 3: Калибровочная кривая колонки SEC с использованием стандартов молекулярной массы. (A) Репрезентативный след FSEC 5HT 2A R, растворенный в DDM, с относительными позициями элюирования стандартов молекулярной массы синего декстрана (пустоты), ферритина, альдолазы, кональбумина и овальбумина. Ферритин, альдолаза, кональбумин и овальбумин окрашены в зеленый, фиолетовый, красный и голубой цвета соответственно. (B) Калибровочная кривая молекулярной массы с использованием положений элюирования эталонов после преобразования в Kav (уравнение 1), построенная по отношению к логарифмической молекулярной массе (Mr). Mr 5HT2AR в DDM был интерполирован из кривой с помощью Kav и отображается на кривой (синий квадрат). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. Затем FSEC использовали для оценки качества и свойств рецептора сфингозин-1-фосфата GPCR (S1PR1)15. Клетки насекомых, экспрессирующие GFP-меченный человеческий S1PR 1, обрабатывали для FSEC, как описано в протоколе (рис. 1). Во-первых, оптимальные условия мембранной экстракции были исследованы путем тестирования моющих средств DDM и LMNG против экстракции без моющих средств с помощью SMA (рис. 4A). Индекс монодисперсности использовался для оценки качества образца белка и соотношения между белком в пустоте (удержание колонки ~8 мл) по сравнению с монодисперсным образцом (удержание колонки 14-15 мл). Образец, солюбилизированный в LMNG, показал превосходный профиль FSEC с лучшей формой пика мономера и более низким пиком белкового агрегата, что указывает на то, что солюбилизация и очистка в LMNG были наиболее стабилизирующими условиями для этого мембранного белка. Напротив, образец, солюбилизированный в DDM, имел относительно худший профиль FSEC с большим агрегированным пиком и более широким мономерным пиком, что указывает на полидисперсность в образце. Во-вторых, было исследовано влияние добавления лиганда на профиль FSEC путем добавления сфингозин-1-фосфата (S1P) в образец во время солюбилизации. В этом случае в качестве реагента солюбилизации использовали DDM, и сравнивали следы FSEC S1PR1 в присутствии и отсутствии S1P (рис. 4B). Образец, солюбилизированный в присутствии S1P, показал превосходный след FSEC с уменьшенной агрегацией. Это указывало на то, что очистка в присутствии лиганда была выгодна для улучшения качества образца белка за счет стабилизации рецептора в растворе, но также была выгодна также в качестве суррогатного маркера активности белка, поскольку результаты показали, что белок был правильно свернут и компетентен для связывания лиганда. Рисунок 4: FSEC с использованием сырого экстракта S1PR 1 с указанием оптимальных условий мембранной экстракции и связывания лигандов. (A) Сравнение следов FSEC S1PR1, солюбилизированных в сополимере стирол-малеиновой кислоты (SMA; синий), лаурилмальтозный неопентилгликоль (LMNG; красный) или додецилмальтозид (DDM; черный). (B) Сравнение следов FSEC S1PR 1, солюбилизированных в DDM, в присутствии (красный) или отсутствии (черный) агониста сфингозин-1-фосфата (S1P). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка. FSEC также использовался для исследования долгосрочной стабильности 5HT2AR в различных условиях. 5HT2AR человека, помеченный GFP, растворяли из клеточных мембран насекомых либо в детергенте (DDM), либо в полимере SMA и анализировали с помощью FSEC в несколько моментов времени после хранения при 4 ° C или комнатной температуре (рис. 5). После нескольких дней инкубации 5HT2AR в DDM показал значительное падение высоты мономерного пика при любой температуре, и наблюдалось значительное увеличение совокупного пика. Напротив, 5HT2AR в липидной частице SMA (SMALP) не показал значительного падения высоты мономерного пика в ходе эксперимента, что указывает на то, что белок в SMALP оставался стабильным дольше даже при неблагоприятных температурах. Это может быть важно при рассмотрении белковых препаратов для последующих биофизических применений, таких как эксперименты по поверхностному плазмонному резонансу (SPR), для которых требуется, чтобы образец был стабильным и активным в течение длительного периода времени для успешного завершения экспериментов по связыванию. Рисунок 5: Влияние времени и температуры на качество 5HT 2A R, извлеченного из мембраны с использованием DDM или SMALP, проанализированного FSEC. (A) Репрезентативные следы FSEC 5HT2AR, растворенные в DDM и хранящиеся при комнатной температуре в течение 1 дня (серый),2дня (зеленый) или 5 дней (синий). (B) Гистограммы нормализованной высоты мономерного пика для образцов DDM, хранящихся при 4°C (синий) или RT (зеленый), по сравнению с образцами SMALP, хранящимися при 4°C (серый) или RT (черный). Полосы погрешностей являются репрезентативными для SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Discussion

Общие системные подходы к скринингу состояний с помощью FSEC, представленные здесь, позволяют быстро оптимизировать параметры солюбилизации и очистки для производства мембранных белков. Это означает, что стабильные и функционально активные мембранные белки могут быть быстро получены для биофизических и структурных исследований. Кроме того, FSEC можно проводить с использованием лабораторного оборудования, которое, вероятно, уже установлено в лабораториях мембранных белков, и, таким образом, нет необходимости в покупке специального инструмента для проведения анализов.

Критические шаги
Время, прошедшее между точкой солюбилизации из клеток в моющем средстве и точкой, в которой образец проходит вниз по столбцу SEC (этапы 2.1.5-3.2.5), является критическим по времени, и между этими шагами не должно быть пауз. Все шаги должны выполняться при температуре 4 ° C или на льду, а время, необходимое для выполнения этих шагов, должно быть сведено к минимуму. Эти временные и температурные ограничения необходимы для того, чтобы записать профиль FSEC для мембранного белка до того, как произойдет какое-либо потенциальное развертывание или деградация. После того, как мембранный белок был солюбилизирован, существует больший риск развертывания, агрегации и деградации даже при 4 ° C. В идеале любые образцы, для которых должны быть сравнены трассы FSEC, должны проходить вниз по столбцу SEC через тот же промежуток времени после этапа солюбилизации. На практике это сложно, особенно если образцы передаются последовательно вниз по одному столбцу, но можно собрать до пяти следов SEC с интервалом в 3 часа друг от друга, и в этот период времени не должно быть значительного ухудшения.

Устранение неполадок
Если при проведении эксперимента FSEC наблюдается низкий флуоресцентный сигнал или его отсутствие, возможно, интересующий мембранный белок не экспрессировал выбранную клеточную линию, имеет очень низкую экспрессию выбранной клеточной линии или не был солюбилизирован в выбранном детергенте. Если образцы были разбавлены перед сбором флуоресцентного сигнала и записью следа FSEC, простым первым шагом было бы попробовать более низкое разбавление или отсутствие разбавления фракций SEC. Если это все еще не дает интерпретируемого следа FSEC, следует проверить экспрессию и солюбилизацию белка.

Анализ экспрессии белка может быть достигнут путем проверки флуоресценции образца после шага 2.2.2. Если в этом образце очень низкий флуоресцентный сигнал или его отсутствие (например, сигнал очень близок к фону), вероятно, существует проблема с экспрессией белка. Могут быть предприняты шаги для улучшения уровней экспрессии мембранного белка, такие как переключение на альтернативную клеточную линию или корректировка условий роста, индукции экспрессии и времени между индукцией/инфекцией/трансфекцией и сбором. Однако особенно плохая экспрессия белка может указывать на нестабильный мембранный белок и, следовательно, на плохой выбор конструкции.

Если экспрессия была проверена и имеется четкий флуоресцентный сигнал над фоном до FSEC, эффективность солюбилизации может быть проверена путем измерения оставшегося флуоресцентного сигнала образца после этапа 2.4.3 (растворимый мембранный белок) по сравнению с образцом после этапа 2.2.2 (общий белок). Обычно эффективность солюбилизации составляет 20-30% и при этом позволяет успешно анализировать и очищать мембранный белок. Однако, если эффективность солюбилизации составляет менее 20%, может потребоваться другое моющее средство для солюбилизации или другие условия солюбилизации. Если попытки улучшить солюбилизацию не увенчались успехом, это может указывать на особенно нестабильный мембранный белок и, следовательно, на плохой выбор конструкции.

Если в следе FSEC наблюдается очень поздний пик элюирования (например, 18-24 мл), это указывает на то, что флуоресцентный белок имеет молекулярную массу белка, которая намного ниже, чем ожидалось. Это может быть вызвано деградацией интересующего мембранного белка, что приводит к образованию «свободного» GFP. Следует проверить, не поврежден ли белок до и после солюбилизации, используя флуоресценцию GFP в геле. Если интересующий белок, по-видимому, разлагается или подвергается протеолизу, количество ингибитора протеазы может быть увеличено в два-четыре раза. Однако высокая чувствительность к протеазам или деградированному белку еще до солюбилизации может указывать на особенно нестабильный белок и, следовательно, на плохой выбор конструкции.

Модификации и дальнейшее применение FSEC
Как правило, флуоресцентная метка, используемая в FSEC, представляет собой GFP или eGFP, как описано в этом протоколе. Тем не менее, существует множество различных флуоресцентных белковых меток. Выбор флуоресцентной метки, которая будет использоваться, зависит от наличия считывателя пластин, который может достичь правильных параметров возбуждения и излучения для записи флуоресцентного сигнала для выбранной флуоресцентной метки, и наличия флуорофора с незначительным изменением квантового выхода в различных условиях окружающей среды. Кроме того, FSEC не ограничивается флуоресцентными белками, но также может одинаково хорошо работать с белком, который был помечен флуоресцентным красителем. Например, можно использовать краситель NTA, который будет благоприятно связываться с мембранными белковыми конструкциями, меченными гистидином. Кроме того, либо флуоресцентно меченное антитело, химически меченное флуоресцентным красителем и специфичное для связывания интересующего мембранного белка, либо метка очистки, включенная в конструкцию мембранного белка, может косвенно маркировать мишень для FSEC.

При проведении скрининга моющих средств с использованием FSEC можно сделать выбор относительно того, должен ли буфер, используемый для запуска колонки SEC, содержать соответствующее моющее средство, в котором белок был солюбилизирован, или стандартное моющее средство следует использовать во всех циклах. Более точное представление о поведении белка будет получено, если весь эксперимент будет выполнен с соответствующим моющим средством. Тем не менее, это может занять много времени и расточительно моющее средство, если колонна должна быть перебалансирована в новом моющем средстве перед каждым запуском. Кроме того, поскольку основной целью скрининга моющих средств является сравнение следов, тенденции останутся в следах, даже если условия не идеальны. Таким образом, может быть достигнут компромисс, в соответствии с которым белок растворяется в интересующем детергенте, но колонка проходит в стандартном буфере с одним моющим средством на всех ходах (например, DDM)¹¹, что может сэкономить время и расходные материалы для моющего средства.

Модифицируя используемое оборудование FLPC, можно значительно увеличить пропускную способность протокола FSEC и свести к минимуму требования к образцам. Например, система FPLC или HPLC может быть оснащена автоподатчиком, аналитической колонкой меньшего объема слоя (например, аналитической колонкой SEC объемом 3,2 мл) и встроенным флуоресцентным детектором для мониторинга непрерывных следов FSEC непосредственно из колонки. Результирующая установка позволит выполнять больше прогонов FSEC за более короткий промежуток времени и устранит этап ручного построения графика, что позволит протестировать большее количество условий в более короткие сроки. Кроме того, потребность в выборке будет еще более снижена, поскольку для каждого прогона потребуется готовить и загружать в колонку FSEC меньшее количество проб. Это открыло бы возможности для сведения культур экспрессии к формату на основе пластин, поскольку для анализа потребовалось бы так мало материала.

Сильные и слабые стороны FSEC по сравнению с другими методами
Недостатком FSEC является то, что конструкции мембранного белка должны быть спроектированы таким образом, чтобы вводить флуоресцентную метку, и при введении существует небольшая вероятность того, что размещение метки может помешать функции или сворачиванию интересующего мембранного белка. Кроме того, протокол FSEC, как описано здесь, контролирует характеристики мембранного белка в присутствии клеточного лизата, который представляет собой сырую смесь белков. Поведение мембранного белка в этой среде может отличаться от того, когда интересующий мембранный белок подвергается препаративной колонке SEC в конце очистки, когда он полностью изолирован от других белков. Кроме того, FSEC обеспечивает несколько качественную меру качества белка. Однако, преобразуя след FSEC в индекс монодисперсности, как описано на шаге 4.3.3 протокола, можно получить количественную меру качества белка.

FSEC — не единственный метод, который можно использовать для раннего анализа конструкций мембранных белков, условий солюбилизации и состава буфера очистки. Альтернативные подходы имеют как преимущества, так и недостатки по сравнению с FSEC. Например, существуют анализы термостабильности на основе фторофора, в частности, использование красителя 7-диэтиламино-3-(4′-малеимидилфенил)-4-метилкумарина (CPM)^16,17. Преимущество этого метода заключается в том, что, в отличие от FSEC, который обеспечивает качественную меру качества белка, анализы термостабильности обеспечивают количественную меру в виде относительной температуры плавления. Кроме того, нет необходимости вводить флуоресцентную метку на белковую конструкцию. Однако недостатки анализов термостабильности по сравнению с FSEC заключаются в том, что необходимо использовать очищенный белок и что анализ не совместим со всеми белковыми конструкциями, поскольку он опирается на выгодное положение нативных остатков цистеина в свернутом белке.

Другим методом, который имеет сходство как с FSEC, так и с анализами термостабильности на основе флуорофора, является анализ, который измеряет температурную чувствительность мембранного белка. В этом анализе белок подвергается воздействию различных температур, и обнаруживается белок, который остается в растворе после центрифугирования. Детектирование в этом способе проводилось несколькими способами, включая измерение флуоресценции в растворе¹⁸, флуоресценции гелевой полосы¹⁹ SDS-PAGE или интенсивности сигнала в вестерн-блоттинге²⁰. Однако существенным недостатком этих подходов является то, что анализ очень трудоемкий и подвержен высокому уровню шума в результатах, так как каждая отдельная температурная точка должна собираться независимо.

Наконец, несколько более продвинутых биофизических методов могут быть использованы для оценки качества мембранного белка аналогично FSEC, например, проточный дисперсионный анализ²¹, микромасштабный термофорез²² или SPR. Несмотря на то, что эти методы являются очень мощными, недостатком этих методов является потребность в узкоспециализированных инструментах для проведения анализа.

В заключение, FSEC предоставляет бесценный инструмент для использования в кампаниях по производству мембранного белка, и, хотя это не единственный вариант, он имеет несколько явных преимуществ по сравнению с другими методами, перечисленными выше. Всегда рекомендуется перекрестная проверка результатов ортогональными анализами, и ни один из рассмотренных выше методов не является взаимоисключающим друг для друга.

Materials

1 mL and 5 mL plastic syringes	Generic	-	Syringes for transfer of samples
10x EDTA Free Protease inhibitor cocktail	Abcam	ab201111	Protease inhibitors
15 mL tubes	Generic	-	15 mL tubes for pellet preparation and solubilisation
2 mL ultra-centrifuge tubes	Beckman Coulter	344625	Tubes for ultra-centrifuge rotor
50 mL tubes	Generic	-	50 mL tubes for cell harvest
96 deep-well blocks	Greiner	15922302	For collecting 0.2 mL SEC fractions
ÄKTA  V9-L loop valve	Cytiva	29011358	5 posiiton loop valve  for the ÄKTA FPLC system
ÄKTA F9-C fraction collector	Cytiva	29027743	6 position plate fraction collector for the ÄKTA FPLC system
ÄKTA pure 25 L	Cytiva	29018224	FPLC system for running the experiment
Benchtop centrifuge (e.g. Fisherbrand GT4 3L)	Fisher Scientific	15828722	Centrifuge for low-speed spin
Blunt end filling needles	Generic	-	For transfer of samples
Bottle top vacuum filter	Corning	10005490	Bottle top vacuum filter for filtering SEC buffers
Cholesteryl hemisuccinate (CHS)	Generon	CH210-5GM	Additive for detergent solubilisation
Disposable multichannel reseviour	Generic	-	Resevior for addition of water or buffer to 96-well micro-plate
Dodecyl maltoside (DDM)	Glycon	D97002-C-25g	Detergent for solubilisation
eGFP protein standards	BioVision	K815-100	eGFP standards for fluorescent calibration curve
Glycerol	Thermo Scientific	11443297	Glycerol for buffer preparation
HEPES	Thermo Scientific	10411451	HEPES for buffer preparation
High molecular weight SEC calibration standards kit	Cytiva	28403842	Molecular weight calibration kit for SEC
Lauryl maltose neopentylglycol (LMNG)	Generon	NB-19-0055-5G	Detergent for solubilisation
Low molecular  weight SEC calibration standards kit	Cytiva	28403841	Molecular weight calibration kit for SEC
MLA-130 ultra-centrifuge rotor	Beckman Coulter	367114	Rotor for ultracentrifuge that fits 2 mL capacity tubes
Opaque 96-well flat-bottom micro-plate	Corning	10656853	96-well for reading fluorescent signal in plate reader
Optima MAX-XP ultra-centrifuge	Beckman Coulter	393315	Centrifuge for high-speed spin
pH meter	Generic	-	For adjusting the pH of buffers during preparation
Prism	GraphPad	-	Graphing software for plotting traces
Rotary mixer	Fisher Scientific	12027144	Mixer for end over end mixing in the cold
Sodium chloride	Fisher Scientific	10316943	Sodium chloride for buffer preparation
Sodium hydroxide	Fisher Scientific	10488790	Sodium hydroxide for buffer preparation
Spectramax ID3 Plate Reader	Molecular Devices	735-0391	Micro-plate reader capable of reading fluorescence
Stirrer plate	Generic	-	For stirring buffers during preparation
Styrene maleic acid (SMA)	Orbiscope	SMALP 300	Polymer for detergent free extraction
Superdex 200 Increase 10/300 GL	Cytiva	28990944	SEC column for running the experiment. The bed volume of this column is 24 mL. The recommended flow rate for this column in 0.9 ml/min (in water at 4 °C). The maximum pressure limit for this column is 5 MPa.
Vacuum pump	Sartorius	16694-2-50-06	For filtering and degassing buffers