Detta protokoll beskriver ett förfarande för att utföra fluorescerande storleksuteslutningskromatografi (FSEC) på membranproteiner för att bedöma deras kvalitet för nedströms funktionell och strukturell analys. Representativa FSEC-resultat som samlats in för flera G-proteinkopplade receptorer (GPCR) under tvätt- och rengöringsmedelslösliga förhållanden presenteras.
Under membranproteinstrukturell belysning och biofysisk karakterisering är det vanligt att prova många proteinkonstruktioner som innehåller olika taggar, trunkeringar, deletioner, fusionspartnerinsatser och stabiliserande mutationer för att hitta en som inte aggregeras efter extraktion från membranet. Dessutom är buffertscreening för att bestämma tvättmedel, tillsats, ligand eller polymer som ger det mest stabiliserande tillståndet för membranproteinet en viktig praxis. Den tidiga karakteriseringen av membranproteinkvalitet genom fluorescerande storleksuteslutningskromatografi ger ett kraftfullt verktyg för att bedöma och rangordna olika konstruktioner eller förhållanden utan krav på proteinrening, och detta verktyg minimerar också provbehovet. Membranproteinerna måste vara fluorescerande märkta, vanligtvis genom att uttrycka dem med en GFP-tagg eller liknande. Proteinet kan solubiliseras direkt från hela celler och sedan grovt klargöras genom centrifugering; Därefter överförs proteinet till en storleksuteslutningskolonn och ett fluorescerande spår samlas in. Här presenteras en metod för att köra FSEC och representativa FSEC-data på GPCR-målen sfingosin-1-fosfatreceptor (S1PR1) och serotoninreceptor (5HT2AR).
Storleksuteslutningskromatografi (SEC), även känd som gelfiltreringskromatografi, används ofta i proteinvetenskap1. Under SEC separeras proteiner baserat på deras hydrodynamiska radie, vilket är en funktion av proteinstorleken och formen2. I korthet uppnås denna separation genom att applicera proteinproverna under flöde på en packad bädd av porösa pärlor som fungerar som en molekylsikt. Pärlorna som används är ofta tvärbunden agaros med ett definierat intervall av porstorlekar för att tillåta proteiner att antingen komma in eller uteslutas från porerna i pärlorna 3,4,5,6,7. Proteiner med mindre hydrodynamiska radier tillbringar en större andel tid i porerna och strömmar därmed genom den packade bädden i långsammare takt, medan större proteiner tillbringar en större andel tid utanför pärlorna (den uteslutna volymen) och rör sig genom den packade bädden i snabbare takt. SEC kan användas som ett proteinreningssteg när en preparativ kolonn används1. När en analytisk kolumn används kan SEC användas för att analysera proteinkvaliteten och egenskaperna2. Till exempel tenderar proteinaggregat som kan vara närvarande i ett prov och indikerar protein av dålig kvalitet att vara mycket stora, vilket innebär att de bara reser i den uteslutna volymen och därmed elueras från kolonnen vid den tidigaste punkten; Denna volym kallas kolumnen void eller void volume. Dessutom kan molekylviktstandarder användas för att kalibrera kolonnen, vilket gör det möjligt att interpolera en uppskattad molekylvikt för proteinet av intresse från en standardkurva.
Vanligtvis används proteinabsorbansen vid 280 nm för att övervaka proteinelueringen från en storleksuteslutningskolonn. Detta begränsar användningen av SEC som ett analysverktyg tills proteinet av intresse i stort sett är fritt från förorenande proteiner, till exempel vid det sista steget av proteinrening. Fluorescerande SEC (FSEC) använder emellertid ett protein av intresse som är fluorescerande märkt. Därför kan en fluorescerande signal användas för att specifikt övervaka elueringen av proteinet av intresse i närvaro av andra proteiner eller till och med råblandningar 8,9. Eftersom fluorescerande signaler är mycket känsliga kan dessutom framgångsrik analys utföras på prover med extremt låga proteinmängder. Proteinet av intresse är ofta fluorescerande märkt genom att inkludera ett grönt fluorescerande protein (GFP) eller förbättrad GFP (eGFP) -tagg i uttryckskonstruktionen. Den fluorescerande signalen kan sedan övervakas genom excitation vid 395 nm eller 488 nm och detektering av fluorescerande emission vid 509 nm eller 507 nm för GFP respektiveeGFP 10.
Fördelen med att använda en fluorescerande signal för att övervaka proteineluering från en SEC-kolonn gör FSEC till ett värdefullt verktyg för att analysera membranproteinprover när uttrycksnivåerna är särskilt dåliga jämfört med lösliga proteiner. Avgörande är att kvaliteten och egenskaperna hos membranproteiner kan analyseras direkt efter solubilisering från rålysat utan krav på att optimera reningsprocessen först11,12. Av dessa skäl kan FSEC användas för att snabbt analysera membranproteinkvaliteten samtidigt som man undersöker de olika faktorer som kan krävas för att förbättra membraneproteinets beteende i lösning. Till exempel är det vanligt att testa många konstruktioner som innehåller olika taggar, trunkeringar, deletioner, fusionspartnerinsatser och stabiliserande mutationer för att hitta en som inte aggregeras efter extraktion från membranet13,14. Dessutom kan buffertscreening för att bestämma tvättmedel, tillsats, ligand eller polymer som ger det mest stabiliserande tillståndet för membranproteinet definiera den bästa buffertkompositionen för proteinrening eller för att ge stabilitet för nedströms användning, såsom biofysiska analyser eller strukturell karakterisering.
Således är det övergripande målet med FSEC-metoden att samla in en SEC-kolonnelueringsprofil för ett målmembranprotein av intresse. Dessutom, när fluorescens används, samlas detta SEC-spår in så tidigt som möjligt i optimeringen av konstruktionerna och förhållandena före någon långvarig rening. FSEC-spåret kan användas som ett jämförande verktyg för att bedöma sannolikheten för framgång att rena ett membranprotein med olika buffertförhållanden eller membranproteinkonstruktioner. På detta sätt kan insamlingen av FSEC-profiler användas som en snabb iterativ process för att komma fram till optimal konstruktionsdesign och buffertkomposition innan man spenderar ansträngning på att generera de mängder rent protein som krävs för andra analysmetoder.
De generiska systematiska metoderna för tillståndsscreening med FSEC som presenteras här möjliggör snabb optimering av solubiliserings- och reningsparametrar för produktion av membranproteiner. Detta innebär att stabila och funktionellt aktiva membranproteiner snabbt kan produceras för biofysikaliska och strukturella studier. Dessutom kan FSEC drivas med laboratorieutrustning som sannolikt redan finns på plats i membranproteinlaboratorier, och därmed finns det inget krav på inköp av ett specialinstrument för att köra analyserna.
Kritiska steg
Den tid det tar mellan löslighetspunkten från celler i tvättmedel till den punkt där provet förs ner i SEC-kolonnen (steg 2.1.5-3.2.5) är tidskritisk, och det får inte finnas några pauser mellan dessa steg. Alla steg ska utföras vid 4 °C eller på is, och den tid det tar att utföra dessa steg måste hållas till ett minimum. Dessa tids- och temperaturbegränsningar är nödvändiga för att registrera FSEC-profilen för membranproteinet före eventuell utveckling eller nedbrytning. Efter att membranproteinet har solubiliserats finns det en större risk för utveckling, aggregering och nedbrytning, även vid 4 °C. Helst bör alla prover för vilka FSEC-spåren ska jämföras passera SEC-kolumnen under samma tid efter löslighetssteget. I praktiken är detta svårt, särskilt om proverna skickas sekventiellt ner i en enda kolumn, men det är möjligt att samla upp till fem SEC-spår inom 3 timmar från varandra, och inom denna tidsram bör det inte finnas någon signifikant nedbrytning.
Felsökning
Om det vid utförandet av FSEC-experimentet finns låg eller ingen fluorescerande signal, är det möjligt att membranproteinet av intresse inte har uttryckt den valda cellinjen, har mycket lågt uttryck av den valda cellinjen eller inte har solubiliserats i det valda tvättmedlet. Om proverna späddes innan fluorescenssignalen samlades in och FSEC-spåret registrerades, skulle ett enkelt första steg vara att prova en lägre utspädning eller ingen utspädning av SEC-fraktionerna. Om detta fortfarande inte ger ett tolkningsbart FSEC-spår bör proteinets uttryck och löslighet kontrolleras.
Analysen av proteinuttrycket kan uppnås genom kontroll av provets fluorescens efter steg 2.2.2. Om det finns en mycket låg eller ingen fluorescerande signal från detta prov (t.ex. en signal mycket nära bakgrunden) är det troligt ett problem med proteinuttrycket. Åtgärder kan vidtas för att förbättra membranproteinets uttrycksnivåer, såsom byte till en alternativ cellinje eller justering av tillväxtförhållandena, induktionen av uttryck och tiden mellan induktionen/infektionen/transfektionen och skörden. Men särskilt dåligt proteinuttryck kan indikera ett instabilt membranprotein och därmed ett dåligt konstruktionsval.
Om uttrycket har kontrollerats och det finns en tydlig fluorescerande signal ovanför bakgrunden före FSEC, kan löslighetseffektiviteten kontrolleras genom att mäta provets återstående fluorescerande signal efter steg 2.4.3 (lösligt membranprotein) jämfört med provet efter steg 2.2.2 (totalt protein). Det är vanligt att löslighetseffektiviteten är 20% -30% och fortfarande möjliggör framgångsrik analys och rening av membranproteinet. Om löslighetseffektiviteten är mindre än 20% kan emellertid ett annat rengöringsmedel för löslighet eller andra löslighetsförhållanden krävas. Om försök att förbättra solubiliseringen inte lyckas kan detta indikera ett särskilt instabilt membranprotein och därmed ett dåligt konstruktionsval.
Om en mycket sen elueringstopp observeras i FSEC-spåret (t.ex. 18-24 ml), indikerar detta att det fluorescerande proteinet har en proteinmolekylvikt som är mycket lägre än förväntat. Detta kan orsakas av att membranproteinet av intresse bryts ned, vilket resulterar i “fri” GFP. Man bör kontrollera om proteinet är intakt före och efter löslighet med hjälp av GFP-fluorescens i gel. Om proteinet av intresse verkar vara nedbrytande eller proteolyzerat kan mängden proteashämmare ökas dubbelt till fyrfaldigt. En hög känslighet för proteaser eller nedbrutet protein redan före löslighet kan emellertid indikera ett särskilt instabilt protein och därmed ett dåligt konstruktionsval.
Ändringar och ytterligare tillämpningar av FSEC
Vanligtvis är den fluorescerande taggen som används i FSEC GFP eller eGFP, som beskrivs i detta protokoll. Det finns dock många olika fluorescerande proteintaggar tillgängliga. Valet av den fluorescerande taggen som ska användas beror på att ha en plattläsare som kan uppnå rätt excitations- och emissionsparametrar för att registrera den fluorescerande signalen för den valda fluorescerande taggen och ha en fluorofor med liten eller ingen förändring i kvantutbytet under olika miljöförhållanden. Dessutom är FSEC inte begränsat till fluorescerande proteiner utan kan också fungera lika bra med ett protein som har märkts med ett fluorescerande färgämne. Till exempel kan ett NTA-färgämne användas, vilket positivt skulle binda till histidin-märkta membranproteinkonstruktioner. Dessutom kan antingen en fluorescerande märkt antikropp kemiskt märkt med ett fluorescerande färgämne och specifikt för bindning av membranproteinet av intresse eller en reningsetikett inkluderad i membranproteinkonstruktionen indirekt märka ett mål för FSEC.
Vid tvättmedelsscreening med FSEC kan ett val göras om bufferten som används för att köra SEC-kolumnen ska innehålla det matchande tvättmedlet som proteinet har solubiliserats i eller om ett standardtvättmedel ska användas i alla körningar. En mer exakt representation av proteinets beteende kommer att erhållas om hela experimentet utförs med matchande tvättmedel hela tiden. Det kan dock vara tidskrävande och slöseri med tvättmedel om kolonnen måste balanseras i ett nytt tvättmedel innan varje körning utförs. Eftersom huvudsyftet med screening av tvättmedel är att jämföra spår kommer trenderna att finnas kvar i spåren även om förhållandena inte är idealiska. Således kan en kompromiss nås där proteinet solubiliseras i det intressanta tvättmedlet men kolonnen körs i en standardbuffert med ett enda tvättmedel över alla körningar (t.ex. DDM)11, vilket kan spara tid och tvättmedelsförbrukningsmaterial.
Genom att modifiera den använda FLPC-utrustningen kan genomströmningen av FSEC-protokollet ökas avsevärt och provbehovet kan minimeras. Till exempel kan ett FPLC- eller HPLC-system utrustas med en autosampler, en mindre bäddvolymanalyskolonn (såsom en 3,2 ml analytisk SEC-kolonn) och en in-line fluorescerande detektor för övervakning av kontinuerliga FSEC-spår direkt från kolonnen. Den resulterande installationen skulle göra det möjligt att utföra fler FSEC-körningar på kortare tid och ta bort det manuella plottningssteget, vilket gör att ett större antal villkor kan testas inom en kortare tidsram. Dessutom skulle provkravet minskas ytterligare, eftersom färre prover skulle behöva förberedas och laddas på FSEC-kolonnen för varje omgång. Detta skulle öppna möjligheter att reducera uttryckskulturerna till ett plattbaserat format, eftersom så lite material skulle krävas för analysen.
FSEC:s styrkor och svagheter jämfört med andra metoder
En nackdel med FSEC är att membranproteinkonstruktionerna måste utformas för att införa den fluorescerande etiketten, och vid införandet finns det en liten möjlighet att placeringen av etiketten kan störa funktionen eller vikningen av membranproteinet av intresse. Dessutom övervakar FSEC-protokollet, som beskrivs här, egenskaperna hos ett membranprotein i närvaro av celllysat, vilket är en råblandning av proteiner. Beteendet hos ett membranprotein i denna miljö kan vara annorlunda än när membranproteinet av intresse utsätts för en preparativ SEC-kolonn vid slutet av reningen när den är helt isolerad från andra proteiner. Dessutom ger FSEC ett något kvalitativt mått på proteinkvalitet. Genom att omvandla FSEC-spåret till ett monodispersitetsindex, såsom beskrivs i steg 4.3.3 i protokollet, kan emellertid ett kvantitativt mått på proteinkvaliteten erhållas.
FSEC är inte den enda metoden som kan användas vid tidig analys av membranproteinkonstruktioner, löslighetsförhållanden och reningsbuffertsammansättning. De alternativa tillvägagångssätten har både fördelar och nackdelar jämfört med FSEC. Det finns till exempel fluoroforbaserade termostabilitetsanalyser, särskilt användningen av färgämnet 7-dietylamino-3-(4′-maleimidylfenyl)-4-metylkumarin (CPM)16,17. Fördelen med denna metod är att, till skillnad från FSEC, som ger ett kvalitativt mått på proteinkvalitet, ger termostabilitetsanalyser ett kvantitativt mått i form av en relativ smälttemperatur. Dessutom finns det inget krav på att införa en fluorescerande tagg på proteinkonstruktionen. Nackdelarna med termostabilitetsanalyser jämfört med FSEC är emellertid att renat protein måste användas och att analysen inte är kompatibel med alla proteinkonstruktioner, eftersom den bygger på de fördelaktiga positionerna för inhemska cysteinrester i det veckade proteinet.
En annan metod som har likheter med både FSEC och fluoroforbaserade termostabilitetsanalyser är en analys som mäter temperaturkänsligheten hos ett membranprotein. I denna analys utmanas proteinet med olika temperaturer, och proteinet som förblir i lösning efter centrifugering detekteras. Detektion i denna metod har utförts på flera sätt, inklusive mätning av fluorescensen i lösning18, fluorescensen i ett SDS-PAGE-gelband19 eller signalintensiteten i en western blot20. En signifikant nackdel med dessa tillvägagångssätt är emellertid att analysen är mycket arbetsintensiv och benägen för högt brus i resultaten, eftersom varje enskild temperaturpunkt måste samlas in oberoende.
Slutligen kan flera mer avancerade biofysiska tekniker användas för att bedöma membranproteinkvalitet på liknande sätt som FSEC, till exempel flödesinducerad dispersionsanalys21, mikroskala termofores22 eller SPR. Även om det är mycket kraftfulla tillvägagångssätt är nackdelen med dessa metoder kravet på högspecialiserade instrument för att köra analyserna.
Sammanfattningsvis tillhandahåller FSEC ett ovärderligt verktyg för användning i membranproteinproduktionskampanjer, och även om det inte är det enda alternativet, har det flera distinkta fördelar jämfört med andra metoder, som anges ovan. Korsvalidering av resultaten genom ortogonala analyser rekommenderas alltid, och ingen av de metoder som diskuterats ovan utesluter varandra.
The authors have nothing to disclose.
Vi vill tacka för hjälpen och stödet från hela Peak Proteins teamet. Från cellvetenskapsteamet vill vi tacka Ian Hampton för hans värdefulla insikter och vägledning i insektscelluttryck. Vi vill tacka Mark Abbott för att han har tillhandahållit resurser och möjlighet att driva detta projekt.
1 mL and 5 mL plastic syringes | Generic | - | Syringes for transfer of samples |
10x EDTA Free Protease inhibitor cocktail | Abcam | ab201111 | Protease inhibitors |
15 mL tubes | Generic | - | 15 mL tubes for pellet preparation and solubilisation |
2 mL ultra-centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344625 | Tubes for ultra-centrifuge rotor |
50 mL tubes | Generic | - | 50 mL tubes for cell harvest |
96 deep-well blocks | Greiner | 15922302 | For collecting 0.2 mL SEC fractions |
ÄKTA V9-L loop valve | Cytiva | 29011358 | 5 posiiton loop valve for the ÄKTA FPLC system |
ÄKTA F9-C fraction collector | Cytiva | 29027743 | 6 position plate fraction collector for the ÄKTA FPLC system |
ÄKTA pure 25 L | Cytiva | 29018224 | FPLC system for running the experiment |
Benchtop centrifuge (e.g. Fisherbrand GT4 3L) | Fisher Scientific | 15828722 | Centrifuge for low-speed spin |
Blunt end filling needles | Generic | - | For transfer of samples |
Bottle top vacuum filter | Corning | 10005490 | Bottle top vacuum filter for filtering SEC buffers |
Cholesteryl hemisuccinate (CHS) | Generon | CH210-5GM | Additive for detergent solubilisation |
Disposable multichannel reseviour | Generic | - | Resevior for addition of water or buffer to 96-well micro-plate |
Dodecyl maltoside (DDM) | Glycon | D97002-C-25g | Detergent for solubilisation |
eGFP protein standards | BioVision | K815-100 | eGFP standards for fluorescent calibration curve |
Glycerol | Thermo Scientific | 11443297 | Glycerol for buffer preparation |
HEPES | Thermo Scientific | 10411451 | HEPES for buffer preparation |
High molecular weight SEC calibration standards kit | Cytiva | 28403842 | Molecular weight calibration kit for SEC |
Lauryl maltose neopentylglycol (LMNG) | Generon | NB-19-0055-5G | Detergent for solubilisation |
Low molecular weight SEC calibration standards kit | Cytiva | 28403841 | Molecular weight calibration kit for SEC |
MLA-130 ultra-centrifuge rotor | Beckman Coulter | 367114 | Rotor for ultracentrifuge that fits 2 mL capacity tubes |
Opaque 96-well flat-bottom micro-plate | Corning | 10656853 | 96-well for reading fluorescent signal in plate reader |
Optima MAX-XP ultra-centrifuge | Beckman Coulter | 393315 | Centrifuge for high-speed spin |
pH meter | Generic | - | For adjusting the pH of buffers during preparation |
Prism | GraphPad | - | Graphing software for plotting traces |
Rotary mixer | Fisher Scientific | 12027144 | Mixer for end over end mixing in the cold |
Sodium chloride | Fisher Scientific | 10316943 | Sodium chloride for buffer preparation |
Sodium hydroxide | Fisher Scientific | 10488790 | Sodium hydroxide for buffer preparation |
Spectramax ID3 Plate Reader | Molecular Devices | 735-0391 | Micro-plate reader capable of reading fluorescence |
Stirrer plate | Generic | - | For stirring buffers during preparation |
Styrene maleic acid (SMA) | Orbiscope | SMALP 300 | Polymer for detergent free extraction |
Superdex 200 Increase 10/300 GL | Cytiva | 28990944 | SEC column for running the experiment. The bed volume of this column is 24 mL. The recommended flow rate for this column in 0.9 ml/min (in water at 4 °C). The maximum pressure limit for this column is 5 MPa. |
Vacuum pump | Sartorius | 16694-2-50-06 | For filtering and degassing buffers |