Denne protokollen beskriver en prosedyre for å utføre fluorescerende størrelsesekskluderingskromatografi (FSEC) på membranproteiner for å vurdere kvaliteten for nedstrøms funksjonell og strukturell analyse. Representative FSEC-resultater samlet for flere G-proteinkoblede reseptorer (GPCR) under vaskemiddelløselige og vaskemiddelfrie forhold presenteres.
Under strukturell oppklaring av membranprotein og biofysisk karakterisering er det vanlig å prøve mange proteinkonstruksjoner som inneholder forskjellige tagger, trunkeringer, delesjoner, fusjonspartnerinnsettinger og stabiliserende mutasjoner for å finne en som ikke er aggregert etter ekstraksjon fra membranen. Videre er bufferscreening for å bestemme vaskemiddelet, additivet, liganden eller polymeren som gir den mest stabiliserende tilstanden for membranproteinet en viktig praksis. Den tidlige karakteriseringen av membranproteinkvalitet ved fluorescerende størrelsesekskluderingskromatografi gir et kraftig verktøy for å vurdere og rangere forskjellige konstruksjoner eller forhold uten krav om proteinrensing, og dette verktøyet minimerer også prøvekravet. Membranproteinene må være fluorescerende merket, vanligvis ved å uttrykke dem med en GFP-tag eller lignende. Proteinet kan solubiliseres direkte fra hele celler og deretter crudely klargjort ved sentrifugering; Deretter sendes proteinet ned i en størrelsesekskluderingskolonne, og et fluorescerende spor oppsamles. Her presenteres en metode for å kjøre FSEC og representative FSEC-data på GPCR-målene sfingosin-1-fosfatreseptor (S1PR1) og serotoninreseptor (5HT2AR).
Størrelsesekskluderingskromatografi (SEC), også kjent som gelfiltreringskromatografi, brukes ofte i proteinvitenskap1. Under SEC separeres proteiner basert på deres hydrodynamiske radius, som er en funksjon av proteinstørrelsen og formen2. Kort fortalt oppnås denne separasjonen ved å påføre proteinprøvene under strømmen på en pakket seng av porøse perler som fungerer som en molekylsikt. Perlene som brukes er ofte tverrbundet agarose med et definert utvalg av porestørrelser for å tillate proteiner å enten komme inn eller bli ekskludert fra porene i perlene 3,4,5,6,7. Proteiner med mindre hydrodynamiske radier tilbringer en større andel tid i porene og strømmer dermed gjennom det pakkede bedet i en langsommere hastighet, mens større proteiner tilbringer en større andel tid utenfor perlene (det ekskluderte volumet) og beveger seg raskere gjennom det pakkede bedet. SEC kan brukes som et proteinrensingstrinn når en forberedende kolonne brukes1. Når en analytisk kolonne brukes, kan SEC brukes til å analysere proteinkvalitet og egenskaper2. For eksempel har proteinaggregater som kan være tilstede i en prøve og indikerer protein av dårlig kvalitet, en tendens til å være svært store, noe som betyr at de bare reiser i det ekskluderte volumet og dermed blir eluert fra kolonnen på det tidligste punktet; Dette volumet refereres til som Column Void eller Void Volume. Videre kan molekylvektstandarder brukes til å kalibrere kolonnen, slik at en estimert molekylvekt av proteinet av interesse kan interpoleres fra en standardkurve.
Vanligvis brukes proteinabsorbansen ved 280 nm til å overvåke proteinelusjonen fra en størrelsesekskluderingskolonne. Dette begrenser bruken av SEC som et analyseverktøy til proteinet av interesse i stor grad er fri for forurensende proteiner, for eksempel ved det siste trinnet av proteinrensing. Imidlertid bruker fluorescerende SEC (FSEC) et protein av interesse som er fluorescerende merket. Derfor kan et fluorescerende signal brukes til å spesifikt overvåke eluering av proteinet av interesse i nærvær av andre proteiner eller til og med råblandinger 8,9. Videre, da fluorescerende signaler er svært følsomme, kan vellykket analyse utføres på prøver med ekstremt lave proteinmengder. Proteinet av interesse er ofte fluorescerende merket ved å inkludere et grønt fluorescerende protein (GFP) eller forbedret GFP (eGFP) tag i uttrykkskonstruksjonen. Det fluorescerende signalet kan deretter overvåkes ved eksitasjon ved 395 nm eller 488 nm og detektering av fluorescerende utslipp ved henholdsvis 509 nm eller 507 nm for GFP eller eGFP10.
Fordelen med å bruke et fluorescerende signal for å overvåke proteineluering fra en SEC-kolonne gjør FSEC til et verdifullt verktøy for å analysere membranproteinprøver når ekspresjonsnivåene er spesielt dårlige i forhold til løselige proteiner. Avgjørende er at kvaliteten og egenskapene til membranproteiner kan analyseres direkte etter oppløseliggjøring fra rålysater uten krav om å optimalisere renseprosessen først11,12. Av disse grunner kan FSEC brukes til raskt å analysere membranproteinkvaliteten mens du utforsker de forskjellige faktorene som kan være nødvendige for å forbedre oppførselen til membranproteinet i oppløsning. For eksempel er det vanlig å prøve mange konstruksjoner som inneholder forskjellige tagger, trunkeringer, delesjoner, fusjonspartnerinnsettinger og stabiliserende mutasjoner for å finne en som ikke er aggregert etter ekstraksjon fra membranen13,14. Videre kan bufferscreening for å bestemme vaskemiddelet, additivet, liganden eller polymeren som gir den mest stabiliserende tilstanden for membranproteinet, definere den beste buffersammensetningen for proteinrensing eller for å gi stabilitet for nedstrøms bruk, for eksempel biofysiske analyser eller strukturell karakterisering.
Dermed er det overordnede målet med FSEC-metoden å samle en SEC-kolonneelueringsprofil for et målmembranprotein av interesse. Videre, når fluorescens brukes, samles dette SEC-sporet så tidlig som mulig i optimaliseringen av konstruksjonene og forholdene før langvarig rensing. FSEC-sporet kan brukes som et komparativt verktøy for å bedømme sannsynligheten for suksess for å rense et membranprotein med forskjellige bufferbetingelser eller membranproteinkonstruksjoner. På denne måten kan samlingen av FSEC-profiler brukes som en rask iterativ prosess for å komme frem til optimal konstruksjonsdesign og buffersammensetning før du bruker krefter på å generere mengdene rent protein som kreves for andre analysemetoder.
De generiske systematiske tilnærmingene for tilstandsscreening med FSEC som presenteres her, tillater rask optimalisering av oppløselighets- og renseparametere for produksjon av membranproteiner. Dette betyr at stabile og funksjonelt aktive membranproteiner raskt kan produseres for biofysiske og strukturelle studier. Videre kan FSEC kjøres ved hjelp av laboratorieutstyr som sannsynligvis allerede er på plass i membranproteinlaboratorier, og det er derfor ikke krav om kjøp av et spesialinstrument for å kjøre analysene.
Kritiske skritt
Tiden det tar fra solubiliseringspunktet fra celler i vaskemiddel til det punktet hvor prøven sendes nedover SEC-kolonnen (trinn 2.1.5-3.2.5) er tidskritisk, og det må ikke være noen pauser mellom disse trinnene. Alle trinnene bør utføres ved 4 °C eller på is, og tiden det tar å utføre disse trinnene må holdes på et minimum som mulig. Disse tids- og temperaturbegrensningene er nødvendige for å registrere FSEC-profilen for membranproteinet før potensiell utfolding eller nedbrytning. Etter at membranproteinet er solubilisert, er det større risiko for utfolding, aggregering og nedbrytning, selv ved 4 °C. Ideelt sett bør alle prøver som FSEC-sporene skal sammenlignes for, passere SEC-kolonnen i samme tid etter oppløselighetstrinnet. I praksis er dette vanskelig, spesielt hvis prøvene sendes sekvensielt ned i en enkelt kolonne, men det er mulig å samle opptil fem SEC-spor innen 3 timer fra hverandre, og i denne tidsrammen bør det ikke være betydelig nedbrytning.
Feilsøking
Hvis det ved utførelse av FSEC-eksperimentet er lavt eller ingen fluorescerende signal, er det mulig at membranproteinet av interesse ikke har uttrykt den valgte cellelinjen, har svært lavt uttrykk for den valgte cellelinjen, eller ikke har blitt solubilisert i det valgte vaskemiddelet. Hvis prøvene ble fortynnet før innsamling av fluorescenssignalet og registrering av FSEC-sporet, ville et enkelt første skritt være å prøve en lavere fortynning eller ingen fortynning av SEC-fraksjonene. Hvis dette fortsatt ikke gir et tolkbart FSEC-spor, bør uttrykket og oppløseliggjøringen av proteinet kontrolleres.
Analysen av proteinuttrykk kan oppnås ved å kontrollere fluorescensen av prøven etter trinn 2.2.2. Hvis det er et veldig lavt eller ingen fluorescerende signal fra denne prøven (f.eks. et signal veldig nær bakgrunnen), er det sannsynligvis et problem med proteinuttrykket. Det kan tas skritt for å forbedre ekspresjonsnivåene av membranproteinet, for eksempel å bytte til en alternativ cellelinje eller justere vekstbetingelsene, induksjonen av ekspresjon og tiden mellom induksjonen / infeksjonen / transfeksjonen og høstingen. Imidlertid kan spesielt dårlig proteinuttrykk indikere et ustabilt membranprotein og dermed et dårlig konstruksjonsvalg.
Hvis uttrykket er kontrollert og det er et klart fluorescerende signal over bakgrunnen før FSEC, kan oppløselighetseffektiviteten kontrolleres ved å måle det gjenværende fluorescerende signalet til prøven etter trinn 2.4.3 (løselig membranprotein) sammenlignet med prøven etter trinn 2.2.2 (totalt protein). Det er vanlig at oppløselighetseffektiviteten er 20% -30% og fortsatt tillater vellykket analyse og rensing av membranproteinet. Imidlertid, hvis oppløselighetseffektiviteten er mindre enn 20%, kan det være nødvendig med et annet vaskemiddel for oppløseliggjøring eller forskjellige oppløselighetsforhold. Hvis forsøk på å forbedre oppløseliggjøringen ikke lykkes, kan dette indikere et spesielt ustabilt membranprotein og dermed et dårlig konstruksjonsvalg.
Hvis en veldig sen eluerende topp observeres i FSEC-sporet (f.eks. 18-24 ml), indikerer dette at det fluorescerende proteinet har en proteinmolekylvekt som er mye lavere enn forventet. Dette kan skyldes at membranproteinet av interesse brytes ned, noe som resulterer i “fri” GFP. Man bør sjekke om proteinet er intakt før og etter oppløseliggjøring ved bruk av GFP-fluorescens i gel. Hvis proteinet av interesse ser ut til å være nedbrytende eller blir proteolysert, kan mengden proteaseinhibitor økes to ganger til fire ganger. Imidlertid kan en høy følsomhet for proteaser eller degradert protein selv før solubilisering indikere et spesielt ustabilt protein og dermed et dårlig konstruksjonsvalg.
Modifikasjoner og videre anvendelser av FSEC
Vanligvis er fluorescerende tag som brukes i FSEC GFP eller eGFP, som beskrevet i denne protokollen. Imidlertid er mange forskjellige fluorescerende proteinkoder tilgjengelige. Valget av fluorescerende tag som skal brukes, avhenger av å ha en plateleser som kan oppnå de riktige eksitasjons- og utslippsparametrene for å registrere det fluorescerende signalet for den valgte fluorescerende taggen og ha en fluorofor med liten eller ingen endring i kvanteutbyttet under forskjellige miljøforhold. Videre er FSEC ikke begrenset til fluorescerende proteiner, men kan også fungere like godt med et protein som er merket med et fluorescerende fargestoff. For eksempel kan et NTA-fargestoff brukes, noe som gunstig vil binde seg til histidinmerkede membranproteinkonstruksjoner. Videre kan enten et fluorescerende merket antistoff kjemisk merket med et fluorescerende fargestoff og spesifikt for binding av membranproteinet av interesse eller en rensekode inkludert i membranproteinkonstruksjonen indirekte merke et mål for FSEC.
Når du utfører vaskemiddelscreening ved hjelp av FSEC, kan det velges om bufferen som brukes til å kjøre SEC-kolonnen, skal inneholde det matchende vaskemiddelet som proteinet er solubilisert i, eller om et standard vaskemiddel skal brukes på tvers av alle løpene. En mer nøyaktig representasjon av proteinets oppførsel vil bli oppnådd dersom hele forsøket utføres med det matchende vaskemiddelet gjennom. Det kan imidlertid være tidkrevende og bortkastet vaskemiddel hvis kolonnen må balanseres i et nytt vaskemiddel før hver kjøring utføres. Siden hovedformålet med vaskemiddelscreening er å sammenligne spor, vil trendene forbli i sporene selv om forholdene ikke er ideelle. Dermed kan man oppnå et kompromiss der proteinet solubiliseres i vaskemiddelet av interesse, men kolonnen kjøres i en standardbuffer med et enkelt vaskemiddel over alle løpene (f.eks. DDM)11, noe som kan spare tid og forbruksvarer for vaskemiddel.
Ved å modifisere FLPC-utstyret som brukes, kan gjennomstrømningen til FSEC-protokollen økes betydelig, og prøvekravet kan minimeres. For eksempel kan et FPLC- eller HPLC-system utstyres med en automatisk prøvetaker, en mindre sengvolumanalytisk kolonne (for eksempel en 3,2 ml analytisk SEC-kolonne) og en inline-fluorescerende detektor for overvåking av kontinuerlige FSEC-spor direkte fra kolonnen. Det resulterende oppsettet vil tillate at flere FSEC-kjøringer utføres på kortere tid og fjerne det manuelle plottetrinnet, slik at et større antall forhold kan testes i en kortere tidsramme. Videre vil prøvekravet bli ytterligere redusert, ettersom færre prøver må utarbeides og lastes inn på FSEC-kolonnen for hver kjøring. Dette ville åpne muligheter for å redusere uttrykkskulturene til et platebasert format, da så lite materiale ville være nødvendig for analysen.
Styrker og svakheter ved FSEC sammenlignet med andre metoder
En ulempe med FSEC er at membranproteinkonstruksjonene må utformes for å introdusere fluorescerende etiketten, og ved introduksjon er det en liten mulighet for at plasseringen av etiketten kan forstyrre funksjonen eller foldingen av membranproteinet av interesse. I tillegg overvåker FSEC-protokollen, som beskrevet her, egenskapene til et membranprotein i nærvær av cellelysat, som er en rå blanding av proteiner. Oppførselen til et membranprotein i dette miljøet kan være annerledes enn når membranproteinet av interesse blir utsatt for en forberedende SEC-kolonne ved slutten av rensingen når den er fullstendig isolert fra andre proteiner. Videre gir FSEC et noe kvalitativt mål på proteinkvalitet. Ved å konvertere FSEC-sporet til en monodispersitetsindeks, som beskrevet i trinn 4.3.3 i protokollen, kan man imidlertid oppnå et kvantitativt mål for proteinkvalitet.
FSEC er ikke den eneste metoden som kan brukes i tidlig analyse av membranproteinkonstruksjoner, oppløselighetsbetingelser og rensingsbuffersammensetning. De alternative tilnærmingene har både fordeler og ulemper i forhold til FSEC. For eksempel finnes fluoroforbaserte termostabilitetsanalyser, spesielt bruken av fargestoffet 7-dietylamino-3-(4′-maleimidylfenyl)-4-metylkumarin (CPM)16,17. Fordelen med denne metoden er at, i motsetning til FSEC, som gir et kvalitativt mål på proteinkvalitet, gir termostabilitetsanalyser et kvantitativt mål i form av en relativ smeltetemperatur. Videre er det ikke noe krav om å innføre en fluorescerende tag på proteinkonstruksjonen. Ulempene med termostabilitetsanalyser sammenlignet med FSEC er imidlertid at renset protein må brukes, og at analysen ikke er kompatibel med alle proteinkonstruksjoner, da den er avhengig av de fordelaktige posisjonene til innfødte cysteinrester i det foldede proteinet.
En annen metode som har likheter med både FSEC og fluoroforbaserte termostabilitetsanalyser er en analyse som måler temperaturfølsomheten til et membranprotein. I denne analysen utfordres proteinet med forskjellige temperaturer, og proteinet som blir igjen i oppløsning etter sentrifugering detekteres. Deteksjon i denne metoden har blitt utført på flere måter, inkludert måling av fluorescens i løsning18, fluorescensen til et SDS-PAGE gelbånd19, eller signalintensiteten i en western blot20. En betydelig ulempe ved disse tilnærmingene er imidlertid at analysen er svært arbeidsintensiv og utsatt for høy støy i resultatene, da hvert enkelt temperaturpunkt må samles uavhengig.
Endelig kan flere mer avanserte biofysiske teknikker brukes til å vurdere membranproteinkvalitet på samme måte som FSEC, for eksempel strømningsindusert dispersjonsanalyse21, mikroskala termoforese22 eller SPR. Selv om det er svært kraftige tilnærminger, er ulempen med disse metodene kravet om høyt spesialiserte instrumenter for å kjøre analysene.
Avslutningsvis gir FSEC et uvurderlig verktøy for bruk i membranproteinproduksjonskampanjer, og selv om det ikke er det eneste alternativet, har det flere forskjellige fordeler i forhold til andre metoder, som nevnt ovenfor. Kryssvalidering av resultatene ved hjelp av ortogonale analyser anbefales alltid, og ingen av metodene diskutert ovenfor utelukker hverandre gjensidig.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gjerne anerkjenne hjelp og støtte fra hele Peak Proteins-teamet. Fra cellevitenskapsteamet vil vi gjerne anerkjenne Ian Hampton for hans verdifulle innsikt og veiledning i insektcelleuttrykk. Vi vil gjerne takke Abbott for å gi ressurser og mulighet til å forfølge dette prosjektet.
1 mL and 5 mL plastic syringes | Generic | - | Syringes for transfer of samples |
10x EDTA Free Protease inhibitor cocktail | Abcam | ab201111 | Protease inhibitors |
15 mL tubes | Generic | - | 15 mL tubes for pellet preparation and solubilisation |
2 mL ultra-centrifuge tubes | Beckman Coulter | 344625 | Tubes for ultra-centrifuge rotor |
50 mL tubes | Generic | - | 50 mL tubes for cell harvest |
96 deep-well blocks | Greiner | 15922302 | For collecting 0.2 mL SEC fractions |
ÄKTA V9-L loop valve | Cytiva | 29011358 | 5 posiiton loop valve for the ÄKTA FPLC system |
ÄKTA F9-C fraction collector | Cytiva | 29027743 | 6 position plate fraction collector for the ÄKTA FPLC system |
ÄKTA pure 25 L | Cytiva | 29018224 | FPLC system for running the experiment |
Benchtop centrifuge (e.g. Fisherbrand GT4 3L) | Fisher Scientific | 15828722 | Centrifuge for low-speed spin |
Blunt end filling needles | Generic | - | For transfer of samples |
Bottle top vacuum filter | Corning | 10005490 | Bottle top vacuum filter for filtering SEC buffers |
Cholesteryl hemisuccinate (CHS) | Generon | CH210-5GM | Additive for detergent solubilisation |
Disposable multichannel reseviour | Generic | - | Resevior for addition of water or buffer to 96-well micro-plate |
Dodecyl maltoside (DDM) | Glycon | D97002-C-25g | Detergent for solubilisation |
eGFP protein standards | BioVision | K815-100 | eGFP standards for fluorescent calibration curve |
Glycerol | Thermo Scientific | 11443297 | Glycerol for buffer preparation |
HEPES | Thermo Scientific | 10411451 | HEPES for buffer preparation |
High molecular weight SEC calibration standards kit | Cytiva | 28403842 | Molecular weight calibration kit for SEC |
Lauryl maltose neopentylglycol (LMNG) | Generon | NB-19-0055-5G | Detergent for solubilisation |
Low molecular weight SEC calibration standards kit | Cytiva | 28403841 | Molecular weight calibration kit for SEC |
MLA-130 ultra-centrifuge rotor | Beckman Coulter | 367114 | Rotor for ultracentrifuge that fits 2 mL capacity tubes |
Opaque 96-well flat-bottom micro-plate | Corning | 10656853 | 96-well for reading fluorescent signal in plate reader |
Optima MAX-XP ultra-centrifuge | Beckman Coulter | 393315 | Centrifuge for high-speed spin |
pH meter | Generic | - | For adjusting the pH of buffers during preparation |
Prism | GraphPad | - | Graphing software for plotting traces |
Rotary mixer | Fisher Scientific | 12027144 | Mixer for end over end mixing in the cold |
Sodium chloride | Fisher Scientific | 10316943 | Sodium chloride for buffer preparation |
Sodium hydroxide | Fisher Scientific | 10488790 | Sodium hydroxide for buffer preparation |
Spectramax ID3 Plate Reader | Molecular Devices | 735-0391 | Micro-plate reader capable of reading fluorescence |
Stirrer plate | Generic | - | For stirring buffers during preparation |
Styrene maleic acid (SMA) | Orbiscope | SMALP 300 | Polymer for detergent free extraction |
Superdex 200 Increase 10/300 GL | Cytiva | 28990944 | SEC column for running the experiment. The bed volume of this column is 24 mL. The recommended flow rate for this column in 0.9 ml/min (in water at 4 °C). The maximum pressure limit for this column is 5 MPa. |
Vacuum pump | Sartorius | 16694-2-50-06 | For filtering and degassing buffers |