מערכת דו-שכבתית של שומנים נתמכת ננו-בר לחקר חלבונים קולטי עקמומיות ממברנה במבחנה
Summary
כאן פותחה מערכת דו-שכבתית של שומנים הנתמכת על ידי ננו-ברים כדי לספק קרום סינתטי עם עקמומיות מוגדרת המאפשרת אפיון של חלבונים בעלי יכולת חישת עקמומיות במבחנה.
Abstract
עקמומיות הממברנה ממלאת תפקידים חשובים בתהליכים חיוניים שונים של תאים, כגון נדידת תאים, חלוקת תאים וסחר בשלפוחית. הוא לא רק נוצר באופן פסיבי על ידי פעילויות תאיות, אלא גם מווסת באופן פעיל אינטראקציות חלבון ומעורב באיתות תוך תאי רבים. לפיכך, יש ערך רב לבחון את תפקידה של עקמומיות הממברנה בוויסות ההתפלגות והדינמיקה של חלבונים ושומנים. לאחרונה פותחו טכניקות רבות לחקר הקשר בין הממברנה המעוקלת לחלבון במבחנה. בהשוואה לטכניקות מסורתיות, דו-שכבת השומנים (SLB) הנתמכת על ידי ננו-ברים שפותחה לאחרונה מציעה הן תפוקה גבוהה והן דיוק טוב יותר ביצירת עקמומיות הממברנה על ידי יצירת דו-שכבה רציפה של שומנים על מערכים מעוצבים של ננו-מוטות עם עקמומיות ממברנה מוגדרת מראש ובקרה שטוחה מקומית. ניתן לאפיין הן את נזילות השומנים והן את רגישות החלבון לממברנות מעוקלות באמצעות הדמיה מיקרוסקופית פלואורסצנטית. כאן מוצג הליך מפורט כיצד ליצור SLB על משטחי זכוכית מפוברקים המכילים מערכי ננו-מוטות ואפיון חלבונים רגישים לעקמומיות על SLB כזה. בנוסף, פרוטוקולים לשימוש חוזר בננו-שבבים ועיבוד תמונה מכוסים. מעבר לננו-בר-SLB, פרוטוקול זה ישים בקלות לכל סוגי שבבי הזכוכית הננו-מובנים למחקרי חישת עקמומיות.
Introduction
עקמומיות הממברנה היא פרמטר פיזיקלי קריטי של התא המתרחש במגוון תהליכים תאיים כגון מורפוגנזה, חלוקת תאים ונדידת תאים1. כיום ידוע כי עקמומיות הממברנה היא מעבר לתוצאה פשוטה של אירועים תאיים; במקום זאת, הוא התגלה כרגולטור יעיל של אינטראקציות חלבונים ואיתות תוך-תאי. לדוגמה, מספר חלבונים המעורבים באנדוציטוזה בתיווך קלתרין נמצאו נקשרים באופן מועדף לממברנה המעוקלת, וכתוצאה מכך נוצרה נקודה חמה לאנדוציטוזה2. ישנם גורמים רבים ושונים לדפורמציה של הממברנה כגון משיכת ממברנה על ידי כוחות השלד הציטוסקטלי, נוכחות של אסימטריה של שומנים עם קבוצות ראש בגדלים שונים, קיומם של חלבונים טרנסממברניים בעלי צורה חרוטית, הצטברות של חלבונים מעצבי ממברנה כמו חלבוני BAR-domain (הקרויים על שם חלבוני בין, אמפיפיסין ו-Rvs), והחדרת תחום הליקסים האמפיפתיים לממברנה1 . באופן מעניין, חלבונים ושומנים אלה לא רק מעוותים את הממברנה אלא יכולים גם לחוש את עקמומיות הממברנה ולהפגין הצטברות מועדפת1. לכן, חיוני לחקור אם וכיצד ממברנות עם עקמומיות שונה משנות את ההתפלגות והדינמיקה של חלבונים ושומנים המחוברים אליהם ואת ההשפעות הפוטנציאליות על התהליכים התוך-תאיים הקשורים אליהם.
טכניקות רבות פותחו כדי לנתח את האינטראקציה בין קרום מעוקל וחלבונים הן בתאים חיים והן במערכות חוץ גופיות. מערכת התאים החיים מספקת סביבת תאים אמיתית עם מגוון שומנים עשיר וויסות איתות חלבוני דינמי 2,3,4,5,6,7. עם זאת, מערכת מתוחכמת כזו קשה לחקור בשל אי הוודאות והתנודות בסביבה התוך תאית. לפיכך, הבדיקות במבחנה באמצעות קרום מלאכותי המורכב ממיני שומנים ידועים וחלבונים מטוהרים הפכו למערכות שחזור חזקות כדי לאפיין את הקשר בין חלבונים לממברנות מעוקלות. באופן מסורתי, ליפוזומים בקטרים שונים נוצרים על ידי שחול כדי לזהות חלבונים רגישים לעקמומיות באמצעות בדיקת שקיעה משותפת באמצעות כוח צנטריפוגלי או בדיקת ציפה משותפת עם שיפוע צפיפות כדי למנוע צבירה של חלבונים 8,9. עם זאת, העקמומיות של הליפוזומים המובלטים מוגבלת על ידי גודל הנקבוביות הזמין של מסנן הממברנה המשמש במכבש10. הוכח כי בדיקת עקמומיות ליפוזום יחיד (SLiC) מתגברת על מגבלה זו, שבה ליפוזומים בקטרים שונים מסומנים פלואורסצנטיים ומשותקים על פני השטח, כך שניתן לסמן את העקמומיות על ידי עוצמת הפלואורסצנטיות11. עם זאת, שונות חזקה בהרכב השומנים נצפתה בשלפוחיות קטנות, המשפיעות על דיוק מדידת העקמומיות12. ניסויים במשיכת קשירה מספקים מדידה מדויקת יותר של העקמומיות על הקשירה החולפת הנמשכת מבועיות חד-לשוניות ענקיות (GUVs) באמצעות פינצטה אופטית, שבה ניתן לשלוט היטב בעקמומיות על ידי מתח הממברנה שנוצר13,14. שיטה זו מתאימה לחקר חלבונים בעלי חישת עקמומיות חיובית או שלילית, אך היא מוגבלת על ידי התפוקה של דור10 של הצינורית. בדיקת צינורות ממברנה נתמכים (SMrT) מאפשרת יצירה בו זמנית של צינורות ממברנה מרובים המובלטים מאותו מאגר שומנים על ידי זרימות מיקרופלואידיות. אף על פי כן, עקמומיות הממברנה משתנה באופן מהותי לאורך הננו-צינורית, מה שפוגע בדיוק של מדידת עקמומיות מבוססת פלואורסצנציה15,16. לשם השוואה, שימוש בשלפוחיות חד-שכבתיות קטנות (SUVs, קוטר <100 ננומטר17) ליצירת דו-שכבתי של שומנים נתמכים (SLB) על משטחים המכילים טופוגרפיות מתוכננות יצר קרום דו-שכבתי יחיד עם עקמומיות שנקבעה מראש על ידי ננו-פבריקציה או ננו-חומרים בדיוק גבוה18,19,20.
כאן אנו מציגים פרוטוקול ליצירת SLB על משטחי ננו-שבבים מפוברקים עם מערכי ננו-ברים וכיצד ניתן להשתמש בו כדי לחקור את רגישות העקמומיות של חלבונים במבחנה. כפי שניתן לראות באיור 1, ישנם שישה מרכיבים חיוניים של הבדיקה: א) ניקוי והרכבה של השבב עם תא מיקרופלואידי; ב) הכנת רכבי שטח עם הרכב שומנים מוגדר; C) היווצרות SLB על ננו-שבב וקשירה עם חלבונים רגישים לעקמומיות; ד) הדמיה ואפיון של SLB וחלבונים רגישים לעקמומיות תחת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית; ה) ניקוי השבב לשימוש חוזר; ו) עיבוד תמונה לניתוח כמותי של יכולת חישת עקמומיות חלבון. הפרוטוקול המפורט מתואר שלב אחר שלב להלן.
Protocol
Representative Results
Discussion
מערכת nanobar-SLB המתוארת כאן מציעה שילוב ייחודי של היתרונות במספר בדיקות קיימות במבחנה. הוא חושף ביעילות את הקשירה המועדפת של חלבונים לממברנות מעוקלות מאוד כבדיקת ציפה או שקיעה של ליפוזום, אך דורש הרבה פחות דגימות ומציע עקמומיות מוגדרת בצורה מדויקת יותר על ננו-ברים בודדים <su…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים למרכז ננו-פבריקציה של נאניאנג (N2FC) ולמרכז לטכנולוגיות פוטוניות משבשות (CDPT) באוניברסיטה הטכנולוגית של נאניאנג (NTU) על התמיכה בייצור ננו-מבנים והדמיית SEM, לפלטפורמת ייצור החלבונים (PPP) בבית הספר למדעי הביולוגיה NTU לטיהור חלבונים, ולבית הספר להנדסה כימית וביו-רפואית NTU למיקרוסקופ הקונפוקלי. עבודה זו ממומנת על ידי משרד החינוך של סינגפור (MOE) (W. Zhao, RG112/20, RG95/21, ו- MOE-T2EP30220-0009), המכון לניתוח מולקולרי דיגיטלי ומדע (IDMxS) הנתמך על ידי מימון MOE במסגרת תוכנית מרכזי המחקר למצוינות (W. Zhao), קרן תוכנית המדע של הגבול האנושי (W. Zhao, RGY0088/2021), מענק הסטארט-אפ של NTU (W. Zhao), בית הספר להנדסה כימית וביו-רפואית NTU עבור מלגת המחקר (X. Miao), ומועצת המלגות של סין עבור מלגת המחקר (J. Wu).
Materials
| Anhydrous Ethanol | Sigma-Aldrich | 100983 | |
| Aluminum foil | Diamond | RN0879999FU | |
| Amber Vial | Sigma-Aldrich | 27115-U | |
| Brain PS: L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 840032 | |
| 10 mL Beaker | Schott-Duran | SCOT211060804 | |
| 50 mL Beaker | Schott-Duran | SCOT211061706 | |
| 1000 mL Beaker | Schott-Duran | SCOT211065408 | The second container |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | V800117 | |
| Cotton buds | Watsons | ||
| 18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 790404 | |
| Egg PC: L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 840051 | |
| F-BAR | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
| F-BAR+IDR | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
| GFP | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
| GFP-His | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
| GraphPad Prism | GraphPad | V9.0.0 | |
| Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS) | Thermo Scientific | H325-500 | |
| IDR from human FBP17 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| ImageJ | National Institutes of Health | 1.50d | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Zeiss | LSM 800 with Airyscan | 100x (N.A.1.4) oil objective. |
| Methanol | Fisher scientific | 10010240 | |
| Mini-extuder | Avanti Polar Lipids, Inc. | 610000-1EA | |
| 1.5 mL Microtubes | Greiner | 616201 | |
| MATLAB | Mathworks | R2018b | |
| Nuclepore Hydrophilic Membrane,0.1 μm | Whatman | 800309 | |
| Phosphate Bufferen Saline (PBS) | Life Technologies Holdings Pte Ltd. | 70013 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) Base | Dow Corning Corporation | SYLGARD 184 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) Crosslinker | Dow Corning Corporation | SYLGARD 184 | |
| Plasma Cleaner | HARRICK PLASMA | PDC-002-HP | |
| Quartz Nanochip | Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD | ||
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 795429 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 258105 | |
| Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt | Life Technologies Holdings Pte Ltd. | T1395MP | |
| Tweezer | Gooi | PDC-002-HP | |
| Ultrasonic Cleaners | Elma | D-78224 | |
| Voterx | Scientific Industries | G560E | |
| Vacuum Desiccator | NUCERITE | 5312 | |
| Water Bath | Julabo | TW8 |
Referências
- McMahon, H. T., Gallop, J. L. Membrane curvature and mechanisms of dynamic cell membrane remodelling. Nature. 438 (7068), 590-596 (2005).
- Zhao, W. et al. Nanoscale manipulation of membrane curvature for probing endocytosis in live cells. Nature Nanotechnology. 12 (8), 750-756 (2017).
- Galic, M. et al. External push and internal pull forces recruit curvature-sensing N-BAR domain proteins to the plasma membrane. Nature Cell Biology. 14 (8), 874-881 (2012).
- Rosholm, K. R. et al. Membrane curvature regulates ligand-specific membrane sorting of GPCRs in living cells. Nature Chemical Biology. 13 (7), 724-729 (2017).
- Lou, H. Y. et al. Membrane curvature underlies actin reorganization in response to nanoscale surface topography. Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (46), 23143-23151 (2019).
- Cail, R. C., Shirazinejad, C. R., Drubin, D. G. Induced nanoscale membrane curvature bypasses the essential endocytic function of clathrin. Journal of Cell Biology. 221 (7), e202109013 (2022).
- Mu, H. et al. Patterning of oncogenic ras clustering in live cells using vertically aligned nanostructure arrays. Nano Letter. 22 (3), 1007-1016 (2022).
- Peter, B. J. et al. BAR domains as sensors of membrane curvature: the amphiphysin BAR structure. Science. 303 (5657), 495-499 (2004).
- Bigay, J., Casella, J. F., Drin, G., Mesmin, B., Antonny, B. ArfGAP1 responds to membrane curvature through the folding of a lipid packing sensor motif. The EMBO Journal. 24 (13), 2244-2253 (2005).
- Ebrahimkutty, M. P., Galic, M. Receptor-free signaling at curved cellular membranes. Bioessays. 41 (10), e1900068 (2019).
- Bhatia, V. K. et al. Amphipathic motifs in BAR domains are essential for membrane curvature sensing. The EMBO Journal. 28 (21), 3303-3314 (2009).
- Larsen, J., Hatzakis, N. S., Stamou, D. Observation of inhomogeneity in the lipid composition of individual nanoscale liposomes. Journal of the American Chemical Society. 133 (28), 10685-10687 (2011).
- Prevost, C. et al. IRSp53 senses negative membrane curvature and phase separates along membrane tubules. Nature Communications. 6, 8529 (2015).
- Simunovic, M. et al. How curvature-generating proteins build scaffolds on membrane nanotubes. Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (40), 11226-11231 (2016).
- Holkar, S. S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Spatial control of epsin-induced clathrin assembly by membrane curvature. Journal of Biological Chemistry. 290 (23), 14267-14276 (2015).
- Dar, S., Kamerkar, S. C., Pucadyil, T. J. Use of the supported membrane tube assay system for real-time analysis of membrane fission reactions. Nature Protocols. 12 (2), 390-400 (2017).
- Nair, P. M., Salaita, K., Petit, R. S., Groves, J. T. Using patterned supported lipid membranes to investigate the role of receptor organization in intercellular signaling. Nature Protocols. 6 (4), 523-539 (2011).
- Lee, I. H., Kai, H., Carlson, L. A., Groves, J. T., Hurley, J. H. Negative membrane curvature catalyzes nucleation of endosomal sorting complex required for transport (ESCRT)-III assembly. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (52), 15892-15897 (2015).
- Beber, A. et al. Membrane reshaping by micrometric curvature sensitive septin filaments. Nature Communications. 10 (1), 420 (2019).
- Bridges, A. A., Jentzsch, M. S., Oakes, P. W., Occhipinti, P., Gladfelter, A. S. Micron-scale plasma membrane curvature is recognized by the septin cytoskeleton. Journal of Cell Biology. 213 (1), 23-32 (2016).
- Li, X. et al. A nanostructure platform for live-cell manipulation of membrane curvature. Nature Protocols. 14 (6), 1772-1802 (2019).
- Su, M. et al. Comparative study of curvature sensing mediated by F-BAR and an intrinsically disordered region of FBP17. iScience. 23 (11), 101712 (2020).
- Mayer, L. D., Hope, M. J., Cullis, P. R. Vesicles of variable sizes produced by a rapid extrusion procedure. Biochimica et Biophysica Acta. 858 (1), 161-168 (1986).
- Santoro, F. et al. Revealing the cell-material interface with nanometer resolution by focused ion beam/scanning electron microscopy. ACS Nano. 11 (8), 8320-8328 (2017).
- Platt, V. et al. Influence of multivalent nitrilotriacetic acid lipid-ligand affinity on the circulation half-life in mice of a liposome-attached His6-protein. Bioconjugate Chemistry. 21 (5), 892-902 (2010).
- Williams, D., Vicogne, J., Zaitseva, I., McLaughlin, S., Pessin, J. E. Evidence that electrostatic interactions between vesicle-associated membrane protein 2 and acidic phospholipids may modulate the fusion of transport vesicles with the plasma membrane. Molecular Biology of the Cell. 20 (23), 4910-4919 (2009).
- El Alaoui, F. et al. Structural organization and dynamics of FCHo2 docking on membranes. Elife. 11, e73156 (2022).
- Seu, K. J. et al. Effect of surface treatment on diffusion and domain formation in supported lipid bilayers. Biophysical Journal. 92 (7), 2445-2450 (2007).
- Hung, Y. F. et al. Amino terminal region of dengue virus NS4A cytosolic domain binds to highly curved liposomes. Viruses. 7 (7), 4119-4130 (2015).
- Hatzakis, N. S. et al. How curved membranes recruit amphipathic helices and protein anchoring motifs. Nature Chemical Biology. 5 (11), 835-841 (2009).
- Johnson, J. M., Ha, T., Chu, S., Boxer, S. G. Early steps of supported bilayer formation probed by single vesicle fluorescence assays. Biophysical Journal. 83 (6), 3371-3379 (2002).
- Jing, Y., Trefna, H., Persson, M., Kasemo, B., Svedhem, S. Formation of supported lipid bilayers on silica: relation to lipid phase transition temperature and liposome size. Soft Matter. 10 (1), 187-195 (2014).
- Cole, R. W., Jinadasa, T., Brown, C. M. Measuring and interpreting point spread functions to determine confocal microscope resolution and ensure quality control. Nature Protocols. 6 (12), 1929-1941 (2011).
- Itoh, T. et al. Dynamin and the actin cytoskeleton cooperatively regulate plasma membrane invagination by BAR and F-BAR proteins. Developmental Cell. 9 (6), 791-804 (2005).
- Florentsen, C. D. et al. Annexin A4 trimers are recruited by high membrane curvatures in giant plasma membrane vesicles. Soft Matter. 17 (2), 308-318 (2021).
- Sarkar, Y., Majumder, R., Das, S., Ray, A., Parui, P. P. Detection of curvature-radius-dependent interfacial pH/polarity for amphiphilic self-assemblies: positive versus negative curvature. Langmuir. 34 (21), 6271-6284 (2018).
- Raiborg, C., Stenmark, H. The ESCRT machinery in endosomal sorting of ubiquitylated membrane proteins. Nature. 458 (7237), 445-452 (2009).
- Alqabandi, M. et al. The ESCRT-III isoforms CHMP2A and CHMP2B display different effects on membranes upon polymerization. BMC Biology. 19 (1), 66 (2021).
- Leitenberger, S. M., Reister-Gottfried, E., Seifert, U. Curvature coupling dependence of membrane protein diffusion coefficients. Langmuir. 24 (4), 1254-1261 (2008).
- Bozelli, J. C., Jr. et al. Membrane curvature allosterically regulates the phosphatidylinositol cycle, controlling its rate and acyl-chain composition of its lipid intermediates. Journal of Biological Chemistry. 293 (46), 17780-17791 (2018).
- Parthasarathy, R., Yu, C. H., Groves, J. T. Curvature-modulated phase separation in lipid bilayer membranes. Langmuir. 22 (11), 5095-5099 (2006).
- Yuan, F. et al. Membrane bending by protein phase separation. Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (11), e2017435118 (2021).
- London, E. Membrane structure-function insights from asymmetric lipid vesicles. Accounts of Chemical Research. 52 (8), 2382-2391 (2019).
- Rossetti, F. F., Textor, M., Reviakine, I. Asymmetric distribution of phosphatidyl serine in supported phospholipid bilayers on titanium dioxide. Langmuir. 22 (8), 3467-3473 (2006).
- Richter, R. P., Maury, N., Brisson, A. R. On the effect of the solid support on the interleaflet distribution of lipids in supported lipid bilayers. Langmuir. 21 (1), 299-304 (2005).
- Wacklin, H. P., Thomas, R. K. Spontaneous formation of asymmetric lipid bilayers by adsorption of vesicles. Langmuir. 23 (14), 7644-7651 (2007).
- Lin, W. C., Blanchette, C. D., Ratto, T. V., Longo, M. L. Lipid asymmetry in DLPC/DSPC-supported lipid bilayers: a combined AFM and fluorescence microscopy study. Biophysical Journal. 90 (1), 228-237 (2006).
