Un sistema a doppio strato lipidico supportato da nanobar per lo studio in vitro di proteine sensibili alla curvatura di membrana
Summary
Qui, viene sviluppato un sistema a doppio strato lipidico supportato da nanobar per fornire una membrana sintetica con una curvatura definita che consente la caratterizzazione di proteine con capacità di rilevamento della curvatura in vitro.
Abstract
La curvatura della membrana svolge un ruolo importante in vari processi essenziali delle cellule, come la migrazione cellulare, la divisione cellulare e il traffico di vescicole. Non solo è generato passivamente dalle attività cellulari, ma regola anche attivamente le interazioni proteiche ed è coinvolto in molte segnalazioni intracellulari. Pertanto, è di grande valore esaminare il ruolo della curvatura della membrana nella regolazione della distribuzione e della dinamica delle proteine e dei lipidi. Recentemente, molte tecniche sono state sviluppate per studiare la relazione tra la membrana curva e la proteina in vitro. Rispetto alle tecniche tradizionali, il nuovo nanobar-supported lipid bilayer (SLB) offre sia un throughput elevato che una migliore precisione nella generazione della curvatura della membrana formando un doppio strato lipidico continuo su matrici modellate di nanobar con una curvatura di membrana predefinita e un controllo piatto locale. Sia la fluidità lipidica che la sensibilità proteica alle membrane curve possono essere caratterizzate quantitativamente utilizzando l’imaging al microscopio a fluorescenza. Qui viene introdotta una procedura dettagliata su come formare un SLB su superfici di vetro fabbricate contenenti array di nanobar e la caratterizzazione delle proteine sensibili alla curvatura su tale SLB. Inoltre, sono coperti i protocolli per il riutilizzo dei nanochip e l’elaborazione delle immagini. Oltre al nanobar-SLB, questo protocollo è facilmente applicabile a tutti i tipi di chip di vetro nanostrutturati per studi di rilevamento della curvatura.
Introduction
La curvatura della membrana è un parametro fisico critico di una cellula che si verifica in una varietà di processi cellulari come la morfogenesi, la divisione cellulare e la migrazione cellulare1. È ampiamente riconosciuto ora che la curvatura della membrana è al di là di un semplice risultato di eventi cellulari; Invece, è emerso come un efficace regolatore delle interazioni proteiche e della segnalazione intracellulare. Ad esempio, è stato scoperto che diverse proteine coinvolte nell’endocitosi mediata da clatrina si legano preferenzialmente alla membrana curva, con conseguente formazione di un hotspot per l’endocitosi2. Ci sono molte cause diverse di deformazione della membrana come l’attrazione della membrana da parte delle forze citoscheletriche, la presenza di asimmetria lipidica con gruppi di testa di dimensioni diverse, l’esistenza di proteine transmembrana con forma conica, l’accumulo di proteine che modellano la membrana come le proteine del dominio BAR (dal nome delle proteine Bin, anfifisina e Rvs) e l’inserimento del dominio delle eliche anfipatiche nella membrana1 . È interessante notare che queste proteine e lipidi non solo deformano la membrana, ma possono anche percepire la curvatura della membrana e mostrare un accumulo preferenziale1. Pertanto, è fondamentale studiare se e come membrane con diverse curvature alterano la distribuzione e la dinamica delle proteine e dei lipidi ad esse collegati e i potenziali impatti sui relativi processi intracellulari.
Molte tecniche sono state sviluppate per analizzare l’interazione tra membrana curva e proteine sia in cellule vive che in sistemi in vitro. Il sistema di cellule vive fornisce un ambiente cellulare reale con una ricca diversità lipidica e regolazione dinamica della segnalazione proteica 2,3,4,5,6,7. Tuttavia, un sistema così sofisticato è difficile da studiare a causa delle incertezze e delle fluttuazioni nell’ambiente intracellulare. Quindi, i saggi in vitro che utilizzano una membrana artificiale composta da specie lipidiche note e proteine purificate sono diventati potenti sistemi di ricostituzione per caratterizzare la relazione tra proteine e membrane curve. Tradizionalmente, liposomi di diversi diametri sono generati per estrusione per rilevare proteine sensibili alla curvatura tramite un saggio di co-sedimentazione utilizzando la forza centrifuga o un saggio di co-flottazione con un gradiente di densità per evitare l’aggregazione proteica 8,9. Tuttavia, la curvatura dei liposomi estrusi è limitata dalla dimensione dei pori disponibile del filtro a membrana utilizzato nell’estrusore10. È stato dimostrato che il test di curvatura a liposoma singolo (SLiC) supera questa limitazione, in cui i liposomi con diametri diversi sono marcati con fluorescenza e immobilizzati sulla superficie in modo che la curvatura possa essere contrassegnata dall’intensità fluorescente11. Tuttavia, è stata osservata una forte variabilità nella composizione lipidica nelle piccole vescicole, che influisce sull’accuratezza della misurazione della curvatura12. Gli esperimenti di tirare il tethering forniscono una misurazione più accurata della curvatura sul cavo transitorio tirato da vescicole unilamellari giganti (GUV) utilizzando una pinzetta ottica, dove la curvatura può essere ben controllata dalla tensione della membrana generata13,14. Questo metodo è adatto per studiare proteine sensibili a curvatura positiva o negativa, ma è limitato dal throughput della generazione del tubo10. Il test SMrT (Supported Membrane Tubes) consente la generazione simultanea di più tubi a membrana che vengono estrusi dallo stesso serbatoio lipidico mediante flussi microfluidici. Tuttavia, la curvatura della membrana varia intrinsecamente lungo il nanotubo, il che compromette l’accuratezza della misurazione della curvatura basata sull’intensità di fluorescenza15,16. In confronto, l’utilizzo di piccole vescicole unilamellari (SUV, diametro <100 nm17) per formare un doppio strato lipidico supportato (SLB) su superfici contenenti topografie progettate ha generato una singola membrana a doppio strato con curvature predeterminate da nanofabbricazione o nanomateriali in alta precisione18,19,20.
Qui, presentiamo un protocollo per la formazione dell’SLB su superfici di nanochip fabbricate con array di nanobar e come può essere utilizzato per sondare la sensibilità alla curvatura delle proteine in vitro. Come mostrato in Figura 1, ci sono sei componenti essenziali del test: A) Pulizia e assemblaggio del chip con una camera microfluidica; B) Preparazione di SUV con composizione lipidica definita; C) Formazione dell’SLB su un nanochip e legame con proteine sensibili alla curvatura; D) Imaging e caratterizzazione delle proteine SLB e curvature sensibili al microscopio a fluorescenza; E) Pulizia del chip per il riutilizzo; F) Elaborazione di immagini per l’analisi quantitativa della capacità di rilevamento della curvatura proteica. Il protocollo dettagliato è descritto passo dopo passo di seguito.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il sistema nanobar-SLB qui descritto offre una combinazione unica dei vantaggi in diversi saggi in vitro esistenti. Rivela in modo efficiente il legame preferenziale delle proteine a membrane altamente curve come il test di galleggiamento o sedimentazione dei liposomi, ma richiede molti meno campioni e offre una curvatura definita con maggiore precisione su singole nanobarre 8,29. Offre inoltre una vasta gamma di curvature controllate con precisione per …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo il Nanyang NanoFabrication Centre (N2FC) e il Centre for Disruptive Photonic Technologies (CDPT) della Nanyang Technological University (NTU) per aver supportato la fabbricazione di nanostrutture e l’imaging SEM, la Protein Production Platform (PPP) presso la School of Biological Sciences NTU per la purificazione delle proteine e la School of Chemical and Biomedical Engineering NTU per il microscopio confocale. Questo lavoro è finanziato dal Ministero della Pubblica Istruzione di Singapore (MOE) (W. Zhao, RG112/20, RG95/21 e MOE-T2EP30220-0009), dall’Institute for Digital Molecular Analytics and Science (IDMxS) supportato dal finanziamento MOE nell’ambito del programma Research Centres of Excellence (W. Zhao), dalla Human Frontier Science Program Foundation (W. Zhao, RGY0088/2021), dalla NTU Start-up Grant (W. Zhao), School of Chemical and Biomedical Engineering NTU per la borsa di studio di ricerca (X. Miao) e China Scholarship Council per la borsa di studio di ricerca (J. Wu).
Materials
| Anhydrous Ethanol | Sigma-Aldrich | 100983 | |
| Aluminum foil | Diamond | RN0879999FU | |
| Amber Vial | Sigma-Aldrich | 27115-U | |
| Brain PS: L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 840032 | |
| 10 mL Beaker | Schott-Duran | SCOT211060804 | |
| 50 mL Beaker | Schott-Duran | SCOT211061706 | |
| 1000 mL Beaker | Schott-Duran | SCOT211065408 | The second container |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | V800117 | |
| Cotton buds | Watsons | ||
| 18:1 DGS-NTA(Ni): 1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)succinyl] (nickel salt) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 790404 | |
| Egg PC: L-α-phosphatidylcholine (Egg, Chicken) | Avanti Polar Lipids, Inc. | 840051 | |
| F-BAR | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
| F-BAR+IDR | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
| GFP | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
| GFP-His | Protein Production Plaftorm, School of Biological Sciences, Nanyang Technological University, Singapore | Proteins and peptide | |
| GraphPad Prism | GraphPad | V9.0.0 | |
| Hydrogen Peroxide, 30% (Certified ACS) | Thermo Scientific | H325-500 | |
| IDR from human FBP17 | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | ||
| ImageJ | National Institutes of Health | 1.50d | |
| Laser Scanning Confocal Microscopy | Zeiss | LSM 800 with Airyscan | 100x (N.A.1.4) oil objective. |
| Methanol | Fisher scientific | 10010240 | |
| Mini-extuder | Avanti Polar Lipids, Inc. | 610000-1EA | |
| 1.5 mL Microtubes | Greiner | 616201 | |
| MATLAB | Mathworks | R2018b | |
| Nuclepore Hydrophilic Membrane,0.1 μm | Whatman | 800309 | |
| Phosphate Bufferen Saline (PBS) | Life Technologies Holdings Pte Ltd. | 70013 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) Base | Dow Corning Corporation | SYLGARD 184 | |
| Polydimethylsiloxane (PDMS) Crosslinker | Dow Corning Corporation | SYLGARD 184 | |
| Plasma Cleaner | HARRICK PLASMA | PDC-002-HP | |
| Quartz Nanochip | Donghai County Alfa Quartz Products CO., LTD | ||
| Sodium Hydroxide | Sigma-Aldrich | 795429 | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 258105 | |
| Texas Red DHPE: Texas Red 1,2-Dihexadecanoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine, Triethylammonium Salt | Life Technologies Holdings Pte Ltd. | T1395MP | |
| Tweezer | Gooi | PDC-002-HP | |
| Ultrasonic Cleaners | Elma | D-78224 | |
| Voterx | Scientific Industries | G560E | |
| Vacuum Desiccator | NUCERITE | 5312 | |
| Water Bath | Julabo | TW8 |
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