Durchflusszytometrie-basierte Quantifizierung und Analyse von Myokard-B-Zellen

Summary

Hier berichten wir über ein Protokoll zur Quantifizierung und Differenzierung von myokardialen B-Lymphozyten basierend auf ihrer Lage im intravaskulären oder endothelialen Raum mittels Durchflusszytometrie.

Abstract

Eine wachsende Zahl von Beweisen zeigt, dass B-Lymphozyten eine wichtige Rolle im Zusammenhang mit der Myokardphysiologie und der myokardialen Anpassung an Verletzungen spielen. In der Literatur gibt es jedoch widersprüchliche Daten zur Prävalenz von Myokard-B-Zellen. Es wurde berichtet, dass B-Zellen sowohl zu den am häufigsten vorkommenden Immunzellen im Nagetierherz gehören als auch vorhanden sind, jedoch mit einer deutlich geringeren Prävalenz als myeloische Zellen oder ziemlich selten sind. In ähnlicher Weise haben mehrere Gruppen beschrieben, dass die Anzahl der myokardialen B-Zellen nach akuter ischämischer Myokardverletzung zunimmt, aber eine Gruppe berichtete über keine Veränderungen in der Anzahl der B-Zellen des verletzten Myokards. Die Implementierung einer gemeinsamen, reproduzierbaren Methode zur Beurteilung der Prävalenz von myokardialen B-Zellen ist entscheidend, um die Beobachtungen verschiedener Forschungsgruppen zu harmonisieren und so die Weiterentwicklung der Untersuchung von B-Zell-Myokardinteraktionen zu fördern. Basierend auf unseren Erfahrungen stammen die scheinbar gegensätzlichen Beobachtungen, die in der Literatur berichtet werden, wahrscheinlich auf die Tatsache, dass murine myokardiale B-Zellen meist intravaskulär und mit dem mikrovaskulären Endothel verbunden sind. Daher ist die Anzahl der B-Zellen, die aus einem murinen Herzen gewonnen werden, äußerst empfindlich gegenüber den Perfusionsbedingungen, die zur Reinigung des Organs verwendet werden, und von der verwendeten Verdauungsmethode. Hier berichten wir über ein optimiertes Protokoll, das diese beiden kritischen Variablen auf spezifische Weise berücksichtigt. Dieses Protokoll ermöglicht eine reproduzierbare, auf Durchflusszytometrie basierende Analyse der Anzahl der murinen myokardialen B-Zellen und ermöglicht es den Forschern, extravaskuläre vs. intravaskuläre myokardiale B-Zellen zu unterscheiden.

Introduction

B-Lymphozyten sind hochspezialisierte Immunzellen, die sowohl bei der adaptiven als auch bei der angeborenen Immunantwort eine wichtige Rolle spielen¹. Es gibt zwei Hauptpopulationen von B-Zellen: eine kleinere Population von B1-Zellen, die hauptsächlich während des embryonalen Lebens produziert werden, und eine überwiegende Population von B2-Zellen, die im Erwachsenenalter im Knochenmark produziert werden¹. Nach der Reifung im Knochenmark wandern B-Zellen zu primären und sekundären lymphatischen Organen. Von dort aus zirkulieren sie kontinuierlich zwischen lymphatischen Organen, die sich durch Blutgefäße und Lymphgefäße bewegen². B-Zellen exprimieren auf ihrer Oberfläche spezifische Antikörper, die als Rezeptoren fungieren. Wenn B-Zellen auf ein Antigen treffen, das an ihren Rezeptor bindet, kann ein aktivierendes Signal ausgelöst werden. Aktivierte B-Zellen wandern entweder in das Gewebe, in dem das Antigen gefunden wurde, oder kehren ins Knochenmark zurück, wo sie zu Antikörper produzierenden Plasmazellen heranreifen^{können 3,4}.

In jüngster Zeit wurde erkannt, dass das Herz eine beträchtliche Population von B-Zellen beherbergt. Studien an Nagetieren haben gezeigt, dass B-Zellen das Herz früh während der Embryonalentwicklung besiedeln⁵ und dass myokardiale B-Zellen meist intravaskuläre, naive B2-Zellen sind, die am Endothel^6,7 haften^, mit einem kleinen Prozentsatz von B1-Zellen⁷. Es gibt noch viele Bereiche der Unsicherheit, aber die verfügbaren Daten deuten darauf hin, dass B-Zellen sowohl im naiven Herzen als auch im Zusammenhang mit der myokardialen Anpassung an Verletzungen eine wichtige Rolle spielen.

Studien am naiven murinen Herzen haben gezeigt, dass myokardiale B-Zellen zu Beginn der Studie hauptsächlich im intravaskulären Raum lokalisiert sind und an das Endothel gebunden sind (>95% der murinen kardialen B-Zellen befanden sich im intravaskulären Raum). Es wurde festgestellt, dass diese B-Zellen andere Genexpressionsmuster aufweisen als zirkulierende B-Zellen, die aus dem peripheren Blut isoliert wurden. Die Analyse naiver Herzen von B-Zell-defizienten Tieren und syngenen Kontrollen ergab, dass Tiere ohne B-Zellen kleinere Herzen und eine höhere Ejektionsfraktion hatten⁶. All diese Beweise deuten darauf hin, dass B-Zellen das Myokardwachstum und/oder die Myokardfunktion modulieren könnten und dass nicht nur interstitielle, sondern auch intravaskuläre B-Zellen für solche Beobachtungen verantwortlich sein könnten. Es wurde auch festgestellt, dass B-Zellen den Phänotyp von myokardialen residenten Makrophagen modulieren⁸.

Mehrere Studien haben gezeigt, dass B-Zellen eine wichtige Rolle im Zusammenhang mit der myokardialen Anpassung an Verletzungen^spielen 8,9,10,11,12,13. B-Zellen reichern sich vorübergehend im verletzten Herzen an, wahrscheinlich durch einen CXCL13-CXCR5-abhängigen Mechanismus^11,13. Von dort aus fördern B-Zellen den nachteiligen kardialen Umbau durch mehrere Mechanismen, zu denen auch die Zytokin-vermittelte Monozytenrekrutierung ^9,12 gehört. Darüber hinaus können B-Zellen Antikörper gegen Herzproteine produzieren, die die Ausdehnung von Herzschäden und nachteiligen kardialen Umbau durch mehrere Mechanismen fördern können 14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25 . B-Zellen können durch die Sekretion von IL-10¹⁰ auch schützende Wirkungen auf das verletzte Herz ausüben.

Da die Zahl der Gruppen, die die Rolle von B-Zellen im naiven und verletzten Herzen untersuchen, wächst, wird es immer wichtiger, gemeinsame Protokolle zu definieren, um myokardiale B-Zellen richtig zu quantifizieren und zu bewerten und so Inkonsistenzen zu vermeiden, die bereits in der Literatur aufgetreten sind. Bisher wurde berichtet, dass B-Zellen eine der häufigsten Immunzellen im Nagetierherz sind⁷ und in einer deutlich geringeren Prävalenz als myeloische Zellen vorhanden sind 26,27 oder ziemlich selten ²⁸. In ähnlicher Weise haben mehrere Gruppen beschrieben, dass die Anzahl der myokardialen B-Zellen nach akuter ischämischer Myokardverletzung zunimmt ^7,9,13, aber eine Gruppe berichtete über keine Veränderungen in der Anzahl der B-Zellen des verletzten Myokards²⁹. Studien an kardialen Immunzellen geben selten Details über die Durchblutungsbedingungen und es gibt keinen Konsens über die Verdauungsbedingungen. Da im Nagetierherz ein großer Teil der B-Zellen intravaskulär ist und die Extraktion von Immunzellen aus dem Myokard stark von der verwendeten Verdauungsmethode abhängt, könnten die in der Literatur berichteten Unterschiede auf Unterschiede in der Organdurchblutung und der Gewebeverdauung zurückzuführen sein.

Hier wird eine detaillierte Methode zur Durchflusszytometrie-basierten Quantifizierung von murinen myokardialen B-Zellen vorgestellt, die die Ausbeute der B-Zell-Erholung durch Optimierung der Perfusions- und Verdauungsbedingungen maximiert und die Unterscheidung von intravaskulären vs. extravaskulären myokardialen B-Zellen ermöglicht⁶. Dieses Protokoll ist eine Anpassung und Optimierung anderer ähnlicher Protokolle, die zwischen intravaskulären und interstitiellen Immunzellen unterscheiden 28,30,31.

In diesem Protokoll standardisieren wir die Myokardperfusion, um B-Zellen zu eliminieren, die im intravaskulären Raum schwimmen, ohne biologisch relevante B-Zellen zu entfernen, die am mikrovaskulären Endothel haften. Aufbauend auf früheren Protokollen, die die Verwendung der intravenösen Injektion von Antikörpern zur Unterscheidung von intravaskulären von interstitiellen Immunzellen^{beschrieben haben 32}, und unter Ausnutzung der Tatsache, dass B-Zellen den Oberflächenmarker B220³³ exprimieren, zeigen wir, wie intravaskuläre vs. extravaskuläre myokardiale B-Zellen durch intravaskuläre Injektion eines B220-spezifischen Antikörpers unmittelbar vor der Tiertötung und Herzperfusion unterschieden werden können. Dieses Protokoll ist relevant für die Forschung eines jeden Wissenschaftlers, der daran interessiert ist, die Analyse von Myokard-B-Zellen im naiven und verletzten Herzen einzubeziehen. Die breite Implementierung dieses Protokolls wird Inkonsistenzen zwischen den Forschungsgruppen reduzieren, die Analyse von Veränderungen in den intravaskulären und extravaskulären myokardialen B-Zell-Pools ermöglichen und somit den Fortschritt der Entdeckungen auf dem Gebiet der kardialen Immunologie unterstützen.

Zusammenfassend stellt das Protokoll einen optimierten Workflow dar, um myokardiale B-Zellen mittels Durchflusszytometrie zu quantifizieren und zu analysieren und gleichzeitig zwischen Zellen im extravaskulären Raum und im intravaskulären Raum zu unterscheiden.

Protocol

Alle in diesem Manuskript beschriebenen Experimente wurden mit Genehmigung der IACUC an der Johns Hopkins University School of Medicine durchgeführt. 1. Vorbereitungen Bereiten Sie den FACS-Puffer vor, wie in Tabelle 1 beschrieben. Stellen Sie sicher, dass genügend CO2 vorhanden ist, um die Tiere einzuschläfern. Bereiten Sie den Sezierraum vor (platzieren Sie das Tischpad und legen Sie das Klebeband und die Sezierwer…

Representative Results

Sobald die Erfassung abgeschlossen ist und alle Ereignisse erfasst sind, sollten die Daten gemäß der Standard-Durchflusszytometrie analysiert werden. Der Fokus der Analyse variiert je nach individuellem Ziel des jeweiligen Experiments. In diesem Fall wurde die Quantifizierung von intravaskulären und extravaskulären B-Zellen durchgeführt, die als Anzahl der Zellen pro mg Gewebe ausgedrückt wurde. Bei der Verwendung eines Spektralzytometers wird empfohlen, die Analyse mit einem ersten Gati…

Discussion

Eine wachsende Zahl von Beweisen deutet darauf hin, dass B-Zellen eine wichtige Rolle im Zusammenhang mit der Myokardphysiologie und dem myokardialen Umbau/der Anpassung an Verletzungen spielen 7,8,9,10,11,12,13,36. Die Durchflusszytometrie ist ein hervorra…

Materials

Alexa Fluor 700 anti-mouse/human CD11b Antibody	101222	BioLegend	100 µg 200 µL
(CellTreat 29481) Cell Strainer, 40 µm, Blue	QBIAP303	Southern Labware
0.5 mL Natural Microcentrifuge Tube	1605-0000	SealRite, USA Scientific
0.9% Sodium Chloride Injection, USP	114-055-101	Quality Biological	0.90%
1.5 mL Natural Microcentrifuge Tube	1615-5500	SealRite, USA Scientific
10 µL Graduated TipOne Filter Tips	11213810	USA Scientific
1000 µL Graduated TipOne Filter Tips	11267810	USA Scientific
15 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free	430052	Corning
1-Way Stop Valve, Polycarbonate	SVPT951	ECT Manufacturing
2,2,2-Tribromoethanol	T48402	Sigma-Aldrich
200 µL Graduated TipOne Filter Tips	11208810	USA Scientific
3-Way Stop Valve, Polycarbonate	SVPT953	ECT Manufacturing
5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube, 12 x 75 mm style	352054	Falcon, a Corning Brand
50 mL Centrifuge Tube, Plug Seal Cap, Polypropylene, RNase-/DNase-free	430290	Corning
ACK (Ammonium-Chloride-Potassium) Lysing Buffer	118-156-101	Quality Biological	Osmolality: 290 + or -5% mOsm/Kg H20
Adapter 4x50ml, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-63	5810759005	Eppendorf
Adapter for 15 mL Centrifuge Tubes, 9 Tubes per Adapter, Conical Bottom for use with Rotor Model A-4-62	22638289	Eppendorf
Adapter for 15 round-bottom tubes 2.6 – 7 mL, for 250 mL rectangular bucket in Rotor A-4-62	22638246	Eppendorf
Aluminum Foil 12 in x 75' Roll .0007	UPC 109153	Reynolds Wrap
Anesthesia Induction Chamber – Mouse	RWD-AICMV-100	Conduct Science
BD Luer Slip Tip Syringe with attached needle 25 G x 5/8 in., sterile, single use, 1 mL	309626	BD Becton, Dickinson and Company
Brandzig Ultra-Fine Insulin Syringes 29G 1cc 1/2" 100-Pack	CMD 2613	Brandzig
Brilliant Violet 421 anti-mouse CD19 Antibody	115537	BioLegend	50 µg/mL
CAPS for Flow Tubes w/strainer mesh 35 µm, Dual position for 12 x 75 mm tubes, sterile	T9009	Southern Labware
Carbon Dioxide USP E CGA 940	CD USPE	AirGas USA
Cole-Parmer Essentials Low-Form Beaker, Glass, 500 mL	UX-34502-46	Cole-Parmer
Collagenase 2	LS004176	Sigma-Aldrich
Connector brass chrome plated 1/4" female NPT x 1/4" barb	Y992611-AG	AirGas USA
Cytek Aurora Flow Cytometer		Cytek Biosciences
Diss 1080 Nipple 1/4 BARB CP	M-08-12	AirGas USA
DNase I – 40,000 U	D4527	Sigma-Aldrich
Easypet 3 – Electronic Pipette Controller	4430000018	Eppendorf
Electronic Balance, AX223/E	30100606	Ohaus Corp.
Eppendorf 5810R centrifuge	5810R	Eppendorf
Eppendorf Research plus 1-channel variable pipettes		Eppendorf
FlowJo 10.8.1		BD Becton, Dickinson and Company
GLACIERbrand, triple density Ice Pan (IPAN-3100)	Z740287	Heathrow Scientific
HBSS (1x) – Ca2+ [+] Mg2+ [+]	14025076	gibco	1x
Hyaluronidase	H3506	Sigma-Aldrich
Kelly Hemostats, Straight	13018-14	Fine Science Tools
Luer Slip Syringe sterile, single use, 20 mL	302831	BD Becton, Dickinson and Company
M1 Adj. Reg 0-100 PSI/CGA940	M1-940-PG	AirGas USA
McKesson Underpads, Moderate	4033-CS150	McKesson
Navigator Multi-Purpose Portable Balance	NV2201	Ohaus Corp.
PBS pH 7.4 (1X) Ca2+ [-] Mg2+ [-]	10010023	gibco	1x
PE anti-mouse/human CD45R/B220 Antibody	103208	BioLegend	200 µg/mL
PerCP/Cyanine5.5 anti-mouse CD45 Antibody	103132	BioLegend	100 µg 500 uL
Petri dish, Stackable 35 mm x 10 mm Sterile Polystyrene	FB0875711YZ	Fisher Scientific
Pkgd: Diss 1080 Nut/CO2/CO2-02	M08-1	AirGas USA
Powerful 6 Watt LED Dual Goose-Neck Illuminator	LED-6W	AmScope
PrecisionGlide Needle 25 G x 5/8 (0.5 mm x 16 mm)	305122	BD Becton, Dickinson and Company
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 (RUO)	553141	BD Becton, Dickinson and Company Biosciences	0.5 mg/mL
R 4.1.1		The R Foundation
Razor Blades	9501250000	Accutec Blades Inc
Regulator analytical two stage 0-25 psi delivery CGA320 3500 psi inlet	Y12244A320-AG	AirGas USA
Rotor A-4-62, incl. 4 x 250 mL rectangular buckets	Rotor A-4-62	Eppendorf
Serological pipette, plugged, 10 mL, sterile, non-pyrogenic/endotoxin-free, non-cytotoxic, 1 piece(s)/blister	86.1254.001	Sarstedt AG & Co KG
Sigma label tape	L8394	Sigma-Aldrich
SpectroFlo 3.0.0		Cytek Biosciences
Spex VapLock Luer Fitting, PP, Straight, Male Luer Lock x 1/8" Hose Barb; 1/EA	MTLL230-6005	Spex
Std Wall Lab Tubing, Size S2, Excelon, 1/8" ID x 3/16" OD x 1/32" Wall x 50' Long	CG-730-003	Excelon Laboratory
Syringe PP/PE without needle, 3 mL	Z683566	Millipore Sigma
Syringe pump	55-1199 (95-240)	Harvard Apparatus
Thomas 3-Channel Alarm Timer TM10500	9371W13	Thomas Scientific
Tube Rack, 12 positions, 6 for 5.0 mL and 15 mL tubes and 6 for 25 mL and 50 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable	30119835	Eppendorf
Tube Rack, 12 positions, for 5.0 mL and 15 mL tubes, polypropylene, numbered positions, autoclavable	30119827	Eppendorf
TYGON R-3603 Laboratory Tubing, I.D. × O.D. 1/4 in. × 3/8 in.	T8913 (Millipore Sigma)	Tygon, Saint-Gobain
Vortex-Genie 2	SI-0236	Scientific Industries, Inc.
VWR Dissecting Forceps with Guide Pin with Curved Tips	89259-946	Avantor, by VWR
VWR Dissecting Scissors, Sharp Tip, 4½"	82027-578	Avantor, by VWR
VWR Incubating Orbital Shaker, Model 3500I	12620-946	Avantor, by VWR
Zombie Aqua Fixable Viability Kit	423102	BioLegend