전층 피부 열 화상 및 감염을 연구하기 위한 쥐 화상 모델
1UNC Eshelman School of Pharmacy,University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Biochemistry & Pharmacology, School of Biomedical Sciences, Faculty of Medicine, Dentistry and Health Sciences,The University of Melbourne, 3Department of Microbiology & Immunology,University of North Carolina School of Medicine, 4Department of Surgery,University of North Carolina at Chapel Hill, 5Curriculum in Toxicology and Environmental Medicine,University of North Carolina at Chapel Hill, 6Department of Microbiology, Monash Biomedicine Discovery Institute,Monash University
Summary
화상 손상 및 감염의 임상 시나리오를 모방한 모델은 화상 연구를 진행하는 데 필요합니다. 본 프로토콜은 인간에 필적하는 간단하고 재현 가능한 쥐 화상 감염 모델을 보여줍니다. 이것은 새로운 국소 항생제 치료법을 개발하기 위해 화상 후 화상 및 감염에 대한 연구를 용이하게 합니다.
Abstract
화상 유도 방법론은 쥐 모델에서 일관되지 않게 설명됩니다. 재현 가능한 화상 연구를 수행하려면 임상 시나리오를 나타내는 균일한 화상 상처 모델이 필요합니다. 현재 프로토콜은 쥐에서 ~20% 총 체표면적(TBSA) 전층 화상을 생성하는 간단하고 재현 가능한 방법을 설명합니다. 여기서, 수조에서 97°C로 가열된 22.89cm2 (직경 5.4 cm)의 구리 막대를 랫트 피부 표면에 도포하여 화상을 유발하였다. 열전도율이 높은 구리 막대는 피부 조직 깊숙이 열을 발산하여 전층 화상을 만들 수 있었습니다. 조직학 분석은 진피와 피하 조직의 전체 두께 범위에 대한 응고 손상으로 약화 된 표피를 보여줍니다. 또한, 이 모델은 면역 조절 장애 및 세균 감염과 같은 화상 손상 후 입원한 화상 환자에서 관찰되는 임상 상황을 대표합니다. 이 모델은 그람 양성균과 그람 음성균 모두에 의한 전신 세균 감염을 요약할 수 있습니다. 결론적으로, 이 논문은 화상 상처 및 감염에 대한 새로운 국소 항생제 개발에 상당한 유용성을 가진 면역 조절 장애 및 박테리아 감염을 포함한 임상 상황을 모방한 배우기 쉽고 강력한 쥐 화상 모델을 제시합니다.
Introduction
화상 부상은 가장 파괴적인 형태의 외상 중 하나이며, 전문 화상 센터에서도 사망률이 12 %에 이릅니다 1,2,3. 최근 발표된 보고서에 따르면 미국에서 매년 ~486,000명의 화상 환자가 치료를 필요로 하며 거의 3,500명이 사망합니다 1,2,3,4,5,6. 화상 손상은 환자의 면역 체계에 큰 도전을 부과하고 치유가 느린 심각한 열린 상처를 만들어 병원, 기회 박테리아에 의한 피부, 폐 및 전신 집락화에 취약하게 만듭니다. 세균 감염과 결합된 면역 조절 장애는 화상 환자의 이환율 및 사망률 증가와 관련이 있다7.
동물 화상 및 감염 모델은 화상 외상과 관련된 피부 손상 및 면역 억제에 따른 박테리아 감염의 발병기전을 연구하는 데 필수적입니다. 이러한 모델을 통해 화상 환자의 세균 감염을 치료하기 위한 새로운 방법을 설계하고 평가할 수 있습니다. 쥐와 인간은 이전에 기록된 것과 유사한 피부 생리적, 병리학적 특성을 공유한다8. 또한 쥐는 크기가 작아 대형 동물 모델보다 다루기 쉽고 저렴하며 조달 및 유지 관리가 더 쉽습니다.
이러한 특성으로 인해 쥐는 화상과 감염을 연구하기에 이상적인 모델 동물입니다9. 불행하게도, 화상 유도를 위한 기술은 일관성이 없고 종종 최소한으로 설명된다10,11,12,13,14. 본 프로토콜은 임상 시나리오를 시뮬레이션하고 면역 억제 및 박테리아 감염을 평가하는 데 사용할 수 있는 쥐 모델에서 일관된 전층 화상 손상을 생성하기 위한 간단하고 비용 효율적이며 재현 가능한 절차를 개발하도록 설계되었습니다.
Protocol
모든 절차는 노스캐롤라이나 대학의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았으며 확립된 지침에 따라 수행되었습니다. 7-9주령의 수컷 및 암컷 Sprague Dawley 랫트(250-300 g)를 실험에 사용하였다. 모든 동물은 12시간 12시간 명암 주기로 사육되었으며 음식과 물을 자유롭게 이용할 수 있습니다. 연구를 시작하기 전에 항상 진통제 계획에 대해 기관 수의사와 협력하십시오. <p class="…
Representative Results
여기에 제시된 프로토콜은 재현성이 높으며 쥐에서 3도 전층 화상 손상을 초래했습니다. 화상 유발 후 화상 상처가 백색으로 나타납니다(그림 2B). 화상 후 72시간 동안 화상 부상의 색상이 흰색에서 갈색으로 변했습니다(그림 2B-E). 조직학적 분석에서 전층 화상(화상 후 24시간 >2.61mm; 그림 3B<…
Discussion
화상 손상의 병태생리학을 연구하기 위해 여러 화상 모델이 제시되었습니다 8,12,16,17. 현재 연구에서 우리는 쥐 모델을 사용하여 환자의 감염된 화상 외상을 시뮬레이션하기 위해 전층 화상을 유도한 후 박테리아 감염을 유도하는 간단하고 재현 가능한 프로토콜을 개발했습니다. 인간 조건을 모방하?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
저자들은 노스 캐롤라이나 대학의 비교 의학부에 동물의 공급과 보살핌에 감사드립니다. 조직 절편 및 이미징을 포함하여 조직병리학/디지털 병리학에 대한 전문 기술 지원을 제공한 병리학 서비스 코어의 Lauren Ralph와 Mia Evangelista에게 감사드립니다. 이 연구는 국방부의 연구 보조금 (수상 번호 W81XWH-20-1-0500, GR 및 TV)의 지원을 받았습니다.
Materials
| 1 mL syringe | BD, USA | 309597 | Used to inject the analgesic |
| 1.7 mL Microtube | Olympus, USA | 24-282 | Used to carry morphine |
| 10% NBF | VWR, USA | 16004-115 | Used to fix the skin piece for staining |
| 30 mL syringe | BD, USA | 302832 | Used to inject the lactate ringer solution |
| 70% ethyl alcohol | Fischer Scientific, USA | BP28184 | |
| Aperio AT2 Digital Pathology Slide Scanner with ImageScope software | Aperio, Technologies Inc., Vista, CA, USA | n/a | Scanning of H & E slides and analysis |
| Cetrimide agar plates | BD, USA | 285420 | Selective media plates for Pseudomonas aeruginosa growth |
| Copper rods | n/a | n/a | Used to induce the burn injury |
| Cotton tipped applicators | OMEGA Surgical supply, USA | 4225-IMC | Used to apply eye ointment |
| Electric shaver | Oster, USA | Golden A5 | Used to remove the dorsal side hairs |
| Eye lube | Dechra, UK | n/a | The eye wetting agent to provide long lasting comfort and avoid eye dryness |
| Fluff filled underpads | Medline, USA | MSC281225 | Used in the burn procedure |
| Forcep | F.S.T. | 11027-12 | Used to hold the skin piece |
| Gauze sponges | Oasis, USA | PK412 | Used to clean the applied nair cream from the dorsal side |
| Heat-resistant gloves | n/a | n/a | Used to hold the heated copper rods |
| Hematology Analyzer | IDEXX laboratories, USA | ProCyte Dx | |
| Induction chamber | Kent Scientific, USA | vetFlo-0730 | Used to anesthesize the animals |
| Insulin syringe | BD, USA | 329461 | |
| Isoflurane | Pivetal, USA | NDC46066-755-04 | Used to anesthesized rats to induce a loss of consciousness |
| Isoflurane vaporiser | n/a | n/a | |
| Lactated ringer's solution | icumedical, USA | NDC0990-7953-09 | Used to resuscitate the rats |
| L-shaped spreader | Fischer Scientific, USA | 14-665-230 | |
| Mannitol Agar | BD, USA | 211407 | Selective media plates for Staphylococcus aureus growth |
| Minicollect tubes (K2EDTA) | greiner bio-one, USA | 450480 | Used to collect the blood |
| Morphine | Mallinckrodt, UK | NDC0406-8003-30 | This analgesia was used to induce the inability to feel burn injury pain |
| Muller Hinton Broth | BD, USA | 275730 | |
| Muller Hinton II Agar | BD, USA | 211438 | |
| Nair hair removal lotion | Nair, USA | n/a | Used to remove the residual hairs on dorsal side |
| Needle 23 G | BD, USA | 305193 | Used to inject the lactate ringer solution |
| Normal saline | n/a | n/a | |
| Spectrophotometer | ThermoScientific, USA | Genesys 30 | |
| Sprague-Dawley rats, male and female | Charles River Labs | n/a | 7-9 weeks old for burn induction |
| Surgical Scissor | F.S.T. | 14501-14 | Used to cut the desired skin piece |
| Tissue collection tubes | Globe Scientific | 220101236 | |
| Tissue Homogenizer | Kinematica, Inc, USA | POLYTRON PT2100 | Used to homogenize the tissue samples |
| Water bath | Fischer Scientific, USA | n/a | Used to induce the burn injury |
| Weighted heating pad | Comfytemp, USA | n/a | Used during the procedure to keep rat's body warm |
Referências
- Peck, M., Molnar, J., Swart, D. A global plan for burn prevention and care. Bulletin of the World Health Organization. 87, 802-803 (2009).
- American Burn Association. Burn incidence and treatment in the United States: 2011 fact sheet. Chicago: American Burn Association. , (2011).
- Miller, S. F., et al. National burn repository 2007 report: a synopsis of the 2007 call for data. Journal of Burn Care & Research. 29 (6), 862-870 (2008).
- Kruger, E., Kowal, S., Bilir, S. P., Han, E., Foster, K. Relationship between patient characteristics and number of procedures as well as length of stay for patients surviving severe burn injuries: analysis of the American Burn Association National Burn Repository. Journal of Burn Care & Research. 41 (5), 1037-1044 (2020).
- American Burn Association. Burn incidence and treatment in the United States: 2016. Burn Incidence Fact Sheet. Chicago: American Burn Association. , (2016).
- Willis, M. L., et al. Plasma extracellular vesicles released after severe burn injury modulate macrophage phenotype and function. Journal of Leukocyte Biology. 111 (1), 33-49 (2022).
- Kartchner, L. B., et al. One-hit wonder: late after burn injury, granulocytes can clear one bacterial infection but cannot control a subsequent infection. Burns. 45 (3), 627-640 (2019).
- Abdullahi, A., Amini-Nik, S., Jeschke, M. Animal models in burn research. Cellular and Molecular Life Sciences. 71 (17), 3241-3255 (2014).
- Cai, E. Z., et al. Creation of consistent burn wounds: a rat model. Archives of Plastic Surgery. 41 (4), 317 (2014).
- Pessolato, A. G. T., dos Santos Martins, D., Ambrósio, C. E., Mançanares, C. A. F., de Carvalho, A. F. Propolis and amnion reepithelialise second-degree burns in rats. Burns. 37 (7), 1192-1201 (2011).
- Gurung, S., Škalko-Basnet, N. Wound healing properties of Carica papaya latex: in vivo evaluation in mice burn model. Journal of Ethnopharmacology. 121 (2), 338-341 (2009).
- Eloy, R., Cornillac, A. Wound healing of burns in rats treated with a new amino acid copolymer membrane. Burns. 18 (5), 405-411 (1992).
- Upadhyay, N., et al. Safety and healing efficacy of Sea buckthorn (Hippophae rhamnoides L.) seed oil on burn wounds in rats. Food and Chemical Toxicology. 47 (6), 1146-1153 (2009).
- El-Kased, R. F., Amer, R. I., Attia, D., Elmazar, M. M. Honey-based hydrogel: In vitro and comparative In vivo evaluation for burn wound healing. Scientific Reports. 7 (1), 1-11 (2017).
- Fan, G. -. Y., et al. Severe burn injury in a swine model for clinical dressing assessment. Journal of Visualized Experiments. (141), e57942 (2018).
- Davenport, L., Dobson, G., Letson, H. A new model for standardising and treating thermal injury in the rat. MethodsX. 6, 2021-2027 (2019).
- Kaufman, T., Lusthaus, S., Sagher, U., Wexler, M. Deep partial skin thickness burns: a reproducible animal model to study burn wound healing. Burns. 16 (1), 13-16 (1990).
- Casal, D., et al. Blood supply to the integument of the abdomen of the rat: a surgical perspective. Plastic and Reconstructive Surgery Global Open. 5 (9), (2017).
- Casal, D., et al. A model of free tissue transfer: the rat epigastric free flap. Journal of Visualized Experiments. (119), e55281 (2017).
- Naldaiz-Gastesi, N., Bahri, O. A., Lopez de Munain, A., McCullagh, K. J., Izeta, A. The panniculus carnosus muscle: an evolutionary enigma at the intersection of distinct research fields. Journal of Anatomy. 233 (3), 275-288 (2018).
- Weber, B., et al. Modeling trauma in rats: similarities to humans and potential pitfalls to consider. Journal of Translational Medicine. 17 (1), 1-19 (2019).
- Nguyen, J. Q. M., et al. Spatial frequency domain imaging of burn wounds in a preclinical model of graded burn severity. Journal of Biomedical Optics. 18 (6), 066010 (2013).
- Sobral, C., Gragnani, A., Morgan, J., Ferreira, L. Inhibition of proliferation of Pseudomonas aeruginosa by KGF in an experimental burn model using human cultured keratinocytes. Burns. 33 (5), 613-620 (2007).
- Olivera, F., Bevilacqua, L., Anaruma, C., Boldrini Sde, C., Liberti, E. Morphological changes in distant muscle fibers following thermal injury i n Wistar rats. Acta Cirurgica Brasileira. 25, 525-528 (2010).
- Davies, J. W. . Physiological Responses to Burning Injury. , (1982).
- Neely, C. J., et al. Flagellin treatment prevents increased susceptibility to systemic bacterial infection after injury by inhibiting anti-inflammatory IL-10+ IL-12-neutrophil polarization. PloS One. 9 (1), e85623 (2014).
- Dunn, J. L., et al. Direct detection of blood nitric oxide reveals a burn-dependent decrease of nitric oxide in response to Pseudomonas aeruginosa infection. Burns. 42 (7), 1522-1527 (2016).
- Gouma, E., et al. A simple procedure for estimation of total body surface area and determination of a new value of Meeh’s constant in rats. Laboratory Animals. 46 (1), 40-45 (2012).
- Dawson, N. The surface-area/body-weight relationship in mice. Australian Journal of Biological Sciences. 20 (3), 687-690 (1967).
- Moins-Teisserenc, H., et al. Severe altered immune status after burn injury is associated with bacterial infection and septic shock. Frontiers in Immunology. 12, 529 (2021).
- Robins, E. V. Immunosuppression of the burned patient. Critical Care Nursing Clinics. 1 (4), 767-774 (1989).
Citar este artigo
Sharma, R., Yeshwante, S., Vallé, Q., Hussein, M., Thombare, V., McCann, S. M., Maile, R., Li, J., Velkov, T., Rao, G. Rat Burn Model to Study Full-Thickness Cutaneous Thermal Burn and Infection. J. Vis. Exp. (186), e64345, doi:10.3791/64345 (2022).