Оптимизация параметров проточной цитометрической сортировки для высокопроизводительной изоляции и очистки малых внеклеточных везикул
Summary
Этот протокол обеспечивает быстрый и специфический по размеру метод выделения небольших внеклеточных везикул за счет оптимизации размера сопла для распыления воздуха, давления жидкости в оболочке, давления потока образца, напряжения, усиления и пороговых параметров запуска.
Abstract
Малые внеклеточные везикулы (sEV) могут высвобождаться из всех типов клеток и переносить белок, ДНК и РНК. Сигнальные молекулы служат индикаторами физиологического и патологического состояния клетки. Тем не менее, не существует стандартного метода выделения sEV, который препятствует последующей идентификации биомаркеров и исследованиям лекарственного вмешательства. В этой статье мы приводим подробный протокол выделения и очистки 50-200 нм sEV с помощью сортировщика проточных ячеек. Для этого было выбрано сопло 50 мкм и давление жидкости в оболочке 80 фунтов на квадратный дюйм для получения хорошей скорости сортировки и стабильного бокового потока. Микросферы полистирола стандартного размера использовались для обнаружения популяций частиц размером 100, 200 и 300 нм. С дополнительной оптимизацией порога срабатывания напряжения, усиления и прямого рассеяния (FSC) сигнал sEV может быть отделен от фонового шума. Эти оптимизации предоставляют панель критических настроек сортировки, которая позволяет получить репрезентативную популяцию sEV, используя только FSC по сравнению с боковым рассеянием (SSC). Метод выделения на основе проточной цитометрии не только обеспечивает высокопроизводительный анализ, но также позволяет проводить синхронную классификацию или протеомный анализ sEV на основе экспрессии биомаркеров, открывая множество последующих исследовательских приложений.
Introduction
Клетка высвобождает внеклеточные везикулы (ВВ) различных размеров, что приводит к появлению сигнальных молекул и мембранных включений, которые важны для межклеточной коммуникации1. EV разных размеров также играют разные биологические роли: 50-200 нм sEV способны точно распределять РНК, ДНК и белки в правильном внеклеточном месте. sEV также помогает определить механизмы секреции, включающие не только регуляцию нормальных физиологических процессов, таких как иммунный надзор, поддержание стволовых клеток, свертывание крови и восстановление тканей, но и патологию, лежащую в основе нескольких заболеваний, таких как прогрессирование опухоли и метастазирование 2,3. Эффективная изоляция и анализ sEV имеют решающее значение для выявления биомаркеров и разработки будущих лекарственных вмешательств.
Благодаря непрерывным исследованиям клинического применения sEV методы выделения sEV выдвинули более высокие требования. Из-за неоднородности sEV по размеру, источнику и содержанию, а также их сходства с другими EV по физико-химическим и биохимическим свойствам не существует стандартного метода выделения sEV 4,5. В настоящее время ультрацентрифугирование, эксклюзионная хроматография (SEC), осаждение полимеров и иммуноаффинный захват являются наиболее распространенными методами выделения sEV6. Ультрацентрифугирование по-прежнему является золотым стандартом выделения sEV в исследованиях, несмотря на то, что оно отнимает много времени, что приводит к низкой чистоте с широким распределением по размерам 40-500 нм и значительным механическим повреждениям sEV после длительного центрифугирования 7,8,9. Осаждение полимеров, в котором обычно используется полиэтиленгликоль (ПЭГ), страдает от неприемлемой чистоты для последующего функционального анализа с сопутствующим осаждением внеклеточных белковых агрегатов и полимерной контаминацией10,11. Методы, основанные на иммуноаффинном захвате, требуют дорогостоящих антител с различной специфичностью, а также имеют проблемы с низким объемом обработки и выходами12,13,14. Размер частиц является одним из основных показателей для оценки чистоты изолированного sEV. Хотя чистота sEV остается недостижимой целью, SEC удаляет большое количество компонентов среды, а частицы sEV, извлеченные методом SEC, в основном находятся в диапазоне 50-200 нм15. Существующие методы имеют несколько недостатков, включая, помимо прочего, трудоемкость, низкую чистоту, низкий выход продукции, плохую воспроизводимость, низкую пропускную способность образцов и потенциальное повреждение sEV, что делает его несовместимым с клиническим использованием16. Таким образом, быстрый, недорогой и специфический по размеру метод выделения sEV, применимый к различным биожидкостям, является насущной необходимостью в нескольких исследовательских и клинических ситуациях.
При проточной цитометрии отдельные частицы анализируются высокопроизводительным, многопараметрическим способом, а подмножества сортируются17. Из-за гетерогенности ЭВ идеальным было бы цитометрическое измерение потока одной частицы, которое использовалось для исследования ВВ в соответствии с парадигмами клеточного анализа, при этом светорассеяние и флуоресцентные метки использовались для идентификации связанных с физиологией особенностей и белковых компонентов18,19,20. Тем не менее, традиционная проточная цитометрия сталкивается с трудностями из-за небольшого размера sEV и низкого содержания поверхностных биомаркеров. Чувствительность проточной цитометрии может быть улучшена за счет оптимизации параметров детектирования для различения фонового шума и sEV независимо от использования прямого рассеяния (FSC), бокового рассеяния (SSC) или порога срабатывания порога флуоресценции19.
В соответствии с настоящим протоколом настройки проточной цитометрической сортировки с высоким разрешением были оптимизированы с использованием флуоресцентных шариков в стандартной комплектации. Выбрав правильный размер сопла, давление жидкости в оболочке, пороговый параметр срабатывания и напряжения, контролирующие интенсивность рассеянного света, мы смогли выделить определенное подмножество sEV из сложной смеси.
Protocol
Representative Results
Discussion
В этом протоколе описывается оптимизированный метод выделения и очистки sEV с заданным размером частиц 50-200 нм с использованием сортировщика проточных ячеек, который был проверен NTA. Метод решил проблему узкого места получения sEV с однородным размером частиц и высокой чистотой, избегая и…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана Научно-исследовательским фондом Чжэцзянского университета китайской медицины (2020ZG29), Базовым исследовательским проектом общественного благосостояния провинции Чжэцзян (LGF19H150006, LTGY23B070001), Проектом Департамента образования провинции Чжэцзян (Y202147028) и Проектом экспериментальных технологий лабораторного отдела Чжэцзянского университета (SJS201712, SYB202130).
Materials
| Centrifuge tube | Beckman Coulter | 344058 | |
| Culture flasks | Corning | 430641 | |
| Dulbecco’s modified eagle medium | Corning Cellgro | 10-013-CV | |
| Fetal bovine serum | SUER | SUER050QY | |
| Flow cell sorter | Beckman Coulter | Moflo Astrios EQ | |
| Human pancreatic cancer cell, PANC-1 | NA | NA | PANC-1 cells were donated by Professor Weijun Yang, College of Life Sciences, Zhejiang University |
| Laser particle size and zeta potential analyzer | Malvern | Zetasizer Nano ZS 90 | |
| Phosphate buffer saline | Gibco | C20012500BT | |
| Polystyrene fluorescent microspheres | Beckman Coulter | 6602336 | |
| Transmission electron microscopy | JEOL | JEM-1200EX | |
| Trypsin-EDTA solution | Gibco | 1713949 | |
| Ultra rainbow fluorescent particles | Beckman Coulter | B28479 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima-L80XP | |
| Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | SW32TI |
Referências
- Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. Journal of Cell Biology. 200 (4), 373-383 (2013).
- Meldolesi, J. Exosomes and ectosomes in intercellular communication. Current Biology. 28 (8), 435-444 (2018).
- Andaloussi, S. E. L., Mäger, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. A. Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews: Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
- Smith, Z. J., et al. Single exosome study reveals subpopulations distributed among cell lines with variability related to membrane content. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 28533 (2015).
- Kalluri, R., LeBleu, V. S. The biology, function, and biomedical applications of exosomes. Science. 367 (6478), (2020).
- Doyle, L. M., Wang, M. Z. Overview of extracellular vesicles, their origin, composition, purpose, and methods for exosome isolation and analysis. Cells. 8 (7), 727 (2019).
- Cvjetkovic, A., Lötvall, J., Lässer, C. The influence of rotor type and centrifugation time on the yield and purity of extracellular vesicles. Journal of Extracellular Vesicles. 3, 23111 (2014).
- Zeringer, E., Barta, T., Li, M., Vlassov, A. V. Strategies for isolation of exosomes. Cold Spring Harbor Protocols. 2015 (4), 319-323 (2015).
- Muller, L., Hong, C. S., Stolz, D. B., Watkins, S. C., Whiteside, T. L. Isolation of biologically-active exosomes from human plasma. Journal of Immunological Methods. 411, 55-65 (2014).
- Taylor, D. D., Shah, S. Methods of isolating extracellular vesicles impact down-stream analyses of their cargoes. Methods. 87, 3-10 (2015).
- Coughlan, C., et al. Exosome isolation by ultracentrifugation and precipitation and techniques for downstream analyses. Current Protocols in Cell Biology. 88 (1), 110 (2020).
- Yang, D., et al. and perspective on exosome isolation – efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Shao, H., et al. Chip-based analysis of exosomal mRNA mediating drug resistance in glioblastoma. Nature Communications. 6, 6999 (2015).
- Zarovni, N., et al. Integrated isolation and quantitative analysis of exosome shuttled proteins and nucleic acids using immunocapture approaches. Methods. 87, 46-58 (2015).
- Sidhom, K., Obi, P. O., Saleem, A. A. Review of exosomal isolation methods: is size exclusion chromatography the best option. International Journal of Molecular Sciences. 21 (18), 6466 (2020).
- Konoshenko, M. Y., Lekchnov, E. A., Vlassov, A. V., Laktionov, P. P. Isolation of extracellular vesicles: general methodologies and latest trends. BioMed Research International. 2018, 8545347 (2018).
- McKinnon, K. M. Flow cytometry: an overview. Current Protocols in Immunology. 120, 1-11 (2018).
- Theodoraki, M. N., Hong, C. S., Donnenberg, V. S., Donnenberg, A. D., Whiteside, T. L. Evaluation of exosome proteins by on-bead flow cytometry. Cytometry A. 99 (4), 372-381 (2021).
- Nolan, J. P., Duggan, E. Analysis of individual extracellular vesicles by flow cytometry. Methods in Molecular Biology. 1678, 79-92 (2018).
- Nolan, J. P., Jones, J. C. Detection of platelet vesicles by flow cytometry. Platelets. 28 (3), 256-262 (2017).
- Dragovic, R. A., et al. Sizing and phenotyping of cellular vesicles using Nanoparticle Tracking Analysis. Nanomedicine. 7 (6), 780-788 (2011).
- Ramirez, M. I., et al. Technical challenges of working with extracellular vesicles. Nanoscale. 10 (3), 881-906 (2018).
- Song, X., et al. Improved strategy for jet-in-air cell sorting with high purity, yield, viability, and genome stability. FEBS Open Bio. 11 (9), 2453-2467 (2021).
- Zucker, R. M., Elstein, K. H., Gershey, E. L., Massaro, E. J. Increasing sensitivity of the Ortho analytical cytofluorograph by modifying the fluid system. Cytometry. 11 (7), 848-851 (1990).
