Характеристика патогенного штамма Escherichia coli , полученного из Oreochromis spp. Фермы с использованием секвенирования всего генома

Summary

Осуществимость стратегий секвенирования всего генома (WGS) с использованием настольных инструментов упростила опрос генома каждого микроба, имеющего отношение к общественному здравоохранению в лабораторных условиях. Описана методологическая адаптация рабочего процесса для бактериальных WGS и представлен конвейер биоинформатики для анализа.

Abstract

Аквакультура является одним из самых быстрорастущих секторов производства продуктов питания во всем мире, а выращивание тилапии (Oreochromis spp.) представляет собой основной культивируемый сорт пресноводных рыб. Поскольку практика аквакультуры восприимчива к микробному загрязнению, полученному из антропогенных источников, необходимо широкое использование антибиотиков, что приводит к тому, что системы аквакультуры становятся важным источником устойчивых к антибиотикам и патогенных бактерий, имеющих клиническое значение, таких как Escherichia coli (E. coli). Здесь устойчивость к противомикробным препаратам, вирулентность и мобиломные особенности патогенного штамма E. coli , извлеченного из внутреннего выращивания Oreochromis spp., были выяснены с помощью секвенирования всего генома (WGS) и анализа in silico . Было проведено тестирование чувствительности к противомикробным препаратам (AST) и WGS. Кроме того, филогенетическая группа, серотип, типирование многолокусных последовательностей (MLST), приобретенная устойчивость к противомикробным препаратам, вирулентность, содержание плазмиды и профагов были определены с использованием различных доступных веб-инструментов. Изолят E. coli проявлял только промежуточную восприимчивость к ампициллину и характеризовался как штамм ONT:H21-B1-ST40 путем типирования на основе WGS. Хотя был обнаружен только один ген, связанный с устойчивостью к противомикробным препаратам [mdf(A)], было идентифицировано несколько вирулентно-ассоциированных генов (VAG) из атипичного энтеропатогенного патотипа E. coli (aEPEC). Кроме того, был обнаружен груз плазмидных репликонов из крупных плазмидных групп и 18 профаго-ассоциированных областей. В заключение, характеристика WGS изолята aEPEC, извлеченного с рыбной фермы в Синалоа, Мексика, позволяет понять его патогенный потенциал и возможный риск для здоровья человека, связанный с потреблением сырых аквакультурных продуктов. Необходимо использовать методы секвенирования следующего поколения (NGS) для изучения микроорганизмов окружающей среды и принять единую систему здравоохранения, чтобы узнать, как возникают проблемы со здоровьем.

Introduction

Аквакультура является одним из самых быстрорастущих секторов производства продуктов питания во всем мире, и ее производственная практика предназначена для удовлетворения растущего спроса на продовольствие для потребления человеком. Мировое производство аквакультуры утроилось с 34 миллионов тонн в 1997 году до 112 тонн в 2017^году1. Основными группами видов, на которые приходилось почти 75% производства, были морские водоросли, карпы, двустворчатые моллюски, сом и тилапия (Oreochromis spp.) ¹. Однако появление заболеваний, вызванных микробными образованиями, неизбежно из-за интенсивного рыбоводства, что приводит к потенциальным экономическим потерям².

Использование антибиотиков в рыбоводстве хорошо известно профилактикой и лечением бактериальных инфекций, что является основным ограничивающим фактором продуктивности ^3,4. Тем не менее, остаточные антибиотики накапливаются в отложениях аквакультуры и воде, оказывая селективное давление и модифицируя связанные с рыбой и проживающие бактериальные сообщества 5,6,7,8. Следовательно, среда аквакультуры служит резервуаром для генов устойчивости к противомикробным препаратам (ARG) и дальнейшего появления и распространения устойчивых к антибиотикам бактерий (ARB) в окружающей среде⁹. В дополнение к бактериальным патогенам, обычно наблюдаемым, влияющим на методы рыбоводства, часто встречаются члены семейства Enterobacteriaceae, включая штаммы патогенов человека Enterobacter spp., Escherichia coli, Klebsiella spp. и Salmonella spp.10. Кишечная палочка является наиболее распространенным микроорганизмом, выделенным из рыбной муки и воды в рыбоводстве 11,12,13,14,15.

Кишечная палочка является универсальной грамотрицательной бактерией, населяющей желудочно-кишечный тракт млекопитающих и птиц как комменсальный член их кишечной микробиоты. Тем не менее, e. coli обладает высокой адаптивной способностью колонизировать и сохраняться в различных экологических нишах, включая почву, отложения, пищу и воду¹⁶. Из-за усиления и потери генов в результате явления горизонтального переноса генов (HGT) e. coli быстро превратилась в хорошо адаптированный устойчивый к антибиотикам патоген, способный вызывать широкий спектр заболеваний у людей и животных^17,18. Исходя из происхождения выделения, патогенные варианты определяются как кишечная патогенная Кишечная палочка (InPEC) или внекишечная патогенная E. coli (ExPEC). Кроме того, InPEC и ExPEC подразделяются на четко определенные патотипы в соответствии с проявлением заболевания, генетическим фоном, фенотипическими признаками и факторами вирулентности (VFs)16,17,19.

Традиционная культура и молекулярные методы для патогенных штаммов E. coli позволили быстро обнаружить и идентифицировать различные патотипы. Однако они могут быть трудоемкими, трудоемкими и часто требуют высокой технической подготовки¹⁹. Кроме того, ни один метод не может быть использован для достоверного изучения всех патогенных вариантов кишечной палочки из-за сложности их генетического фона. В настоящее время эти недостатки были преодолены с появлением технологий высокопроизводительного секвенирования (HTS). Подходы к секвенированию всего генома (WGS) и биоинформационные инструменты улучшили исследование микробной ДНК по доступной цене и в больших масштабах, облегчая углубленную характеристику микробов за один прогон, включая тесно связанные патогенные варианты 20,21,22. В зависимости от биологических вопросов для выполнения анализа данных можно использовать несколько инструментов, алгоритмов и баз данных биоинформатики. Например, если основной целью является оценка наличия ARG, VF и плазмид, такие инструменты, как ResFinder, VirulenceFinder и PlasmidFinder, вместе с связанными с ними базами данных, могут быть хорошей отправной точкой. Carriço et ^al.22 представили подробный обзор различных программ биоинформатики и связанных с ними баз данных, применяемых для анализа микробных WGS, от предварительной обработки необработанных данных до филогенетического вывода.

Несколько исследований продемонстрировали широкую полезность WGS для опроса генома в отношении признаков устойчивости к противомикробным препаратам, патогенного потенциала и отслеживания возникновения и эволюционных отношений клинически значимых вариантов E. coli, полученных из различных источников 23,24,25,26 . WGS позволила идентифицировать молекулярные механизмы, лежащие в основе фенотипической устойчивости к противомикробным препаратам, включая редкие или сложные механизмы резистентности. Это происходит путем обнаружения приобретенных вариантов ARG, новых мутаций в генах-мишенях лекарств или промоторных областях^27,28. Кроме того, WGS предлагает потенциал для вывода профилей устойчивости к противомикробным препаратам, не требуя предварительных знаний о фенотипе резистентности бактериального штамма²⁹. В качестве альтернативы, WGS позволила охарактеризовать мобильные генетические элементы (MME), несущие как устойчивость к противомикробным препаратам, так и признаки вирулентности, что привело к эволюции бактериального генома существующих патогенов. Например, применение WGS во время расследования вспышки кишечной палочки в Германии в 2011 году привело к раскрытию уникальных геномных особенностей явно нового патотипа E. coli; Интересно, что эти штаммы вспышки произошли из группы энтерогрегации E. coli (EAEC), которая приобрела профаг, кодирующий токсин Шига, из энтерогеморрагического патотипа E. coli (EHEC)³⁰.

В данной работе представлена методологическая адаптация рабочего процесса для бактериальных WGS с использованием настольного секвенсора. Кроме того, конвейер биоинформатики предоставляется с использованием веб-инструментов для анализа полученных последовательностей и дальнейшей поддержки исследователей с ограниченным опытом или вообще без опыта в области биоинформатики. Описанные методы позволили выяснить антимикробную устойчивость, вирулентность и мобиломные особенности патогенного штамма E. coli ACM5, выделенного в 2011 году из внутреннего выращивания Oreochromis spp. в Синалоа, Мексика¹².

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Штамм E. coli ACM5 был извлечен путем обработки и культивирования образца рыбы для определения фекальной кишечной палочки (FC)12. Во время отбора проб рыбы у рыбы не было клинических признаков заболевания, бактериальной или грибковой инфекции, и преобладала средн…

Representative Results

Антимикробную восприимчивость определяли методом дисковой диффузии и интерпретировали по критериям точки разрыва CLSI для 12 антибиотиков, охватывающих шесть различных классов противомикробных препаратов, то есть аминогликозиды, β-лактамы, фторхинолоны, нитрофураны, фениколы и антаго?…

Discussion

В этом исследовании представлена адаптация рабочего процесса бактериальной WGS с использованием настольного секвенсора и конвейера для геномной характеристики патогенного варианта E. coli . В зависимости от используемой платформы секвенирования время выполнения (TATs) для влажных ла?…

Materials

Accublock Mini digital dry bath	Labnet	D0100	Dry bath for incubation of tubes
Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter	A63881	Magnetic beads in solution for DNA library purification
DeNovix DS-11	DeNovix Inc.		UV-Vis spectophotometer to check the quality of the gDNA extracted
DNA LoBind Tubes	Eppendorf	0030108418	1.5 mL PCR tubes for DNA library pooling
DynaMag-2 Magnet	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	12321D	Magnetic microtube rack used during magnetic beads-based DNA purification
Gram-negative Multibac I.D.	Diagnostic reseach (Mexico)	PT-35	Commercial standard antibiotic disks for antimicrobial susceptibility testing
MiniSeq Mid Output Kit (300-cycles)	Illumina	FC-420-1004	Reagent cartdrige for paired-end sequencing (2×150)
MiniSeq System Instrument	Illumina	SY-420-1001	Benchtop sequencer used for Next-generation sequencing
MiniSpin centrifuge	Eppendorf	5452000816	Standard centrifuge for tubes
Nextera XT DNA Library Preparation Kit	Illumina	FC-131-1024	Reagents to perform DNA libraries for sequencing. Includes Box 1 and Box 2 reagents for 24 samples
Nextera XT Index Kit v2	Illumina	FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004	Index set A, B, C, D
PhiX Control v3	Illumina	FC-110-3001	DNA library control for sequencing
Precision waterbath	LabCare America	51221081	Water bath shaker used for bacterial culture
Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	Q33231	Reagents for fluorescence-based DNA quantification assay
Qubit 2.0 Fluorometer	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	Q32866	Fluorometer used for fluorescence assay
Qubit Assay tubes	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	Q32856	0.5 mL PCR tubes for fluorescence-based DNA quantification assay
SimpliAmp Thermal Cycler	Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific	A24811	Thermocycler used for DNA library amplification
Spectronic GENESYS 10 Vis	Thermo	335900	Spectophotometer used for bacterial suspension in antimicrobial susceptibility testing
ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit	Zymo Research Inc.	D4300	Kit for genomic DNA extraction (50 preps)