Charakterisierung eines pathogenen Escherichia coli-Stammes aus Oreochromis spp. Farmen mit Ganzgenomsequenzierung

Summary

Die Machbarkeit von Gesamtgenomsequenzierungsstrategien (WGS) mit Tischgeräten hat die Genomabfrage jeder Mikrobe von Relevanz für die öffentliche Gesundheit in einer Laborumgebung vereinfacht. Eine methodische Anpassung des Workflows für bakterielle WGS wird beschrieben und eine bioinformatische Pipeline zur Analyse vorgestellt.

Abstract

Die Aquakultur ist einer der am schnellsten wachsenden lebensmittelproduzierenden Sektoren weltweit, und die Tilapia-Landwirtschaft (Oreochromis spp.) ist die wichtigste Süßwasserfischsorte, die kultiviert wird. Da Aquakulturpraktiken anfällig für mikrobielle Kontamination aus anthropogenen Quellen sind, ist ein umfassender Einsatz von Antibiotika erforderlich, was dazu führt, dass Aquakultursysteme zu einer wichtigen Quelle für antibiotikaresistente und pathogene Bakterien von klinischer Relevanz wie Escherichia coli (E. coli) werden. Hier wurden die antimikrobiellen Resistenz-, Virulenz- und Mobilommerkmale eines pathogenen E. coli-Stammes, der aus Oreochromis spp. aus Inlandzucht gewonnen wurde, durch Whole-Genom-Sequenzierung (WGS) und In-silico-Analyse aufgeklärt. Antimikrobielle Suszeptibilitätstests (AST) und WGS wurden durchgeführt. Darüber hinaus wurden phylogenetische Gruppe, Serotyp, Multilocus-Sequenz-Typisierung (MLST), erworbene antimikrobielle Resistenz, Virulenz, Plasmid und Prophagengehalt mit verschiedenen verfügbaren Web-Tools bestimmt. Das E. coli-Isolat zeigte nur eine intermediäre Empfindlichkeit gegenüber Ampicillin und wurde durch WGS-basierte Typisierung als ONT:H21-B1-ST40-Stamm charakterisiert. Obwohl nur ein einziges antimikrobielles Resistenz-assoziiertes Gen nachgewiesen wurde [mdf(A)], wurden mehrere Virulenz-assoziierte Gene (VAGs) aus dem atypischen enteropathogenen E. coli (aEPEC)-Pathotyp identifiziert. Zusätzlich wurde die Ladung von Plasmid-Replicons aus großen Plasmidgruppen und 18 Prophagen-assoziierten Regionen nachgewiesen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die WGS-Charakterisierung eines aEPEC-Isolats, das aus einer Fischfarm in Sinaloa, Mexiko, gewonnen wurde, Einblicke in sein pathogenes Potenzial und das mögliche Risiko des Verzehrs roher Aquakulturprodukte für die menschliche Gesundheit ermöglicht. Es ist notwendig, Next-Generation-Sequencing-Techniken (NGS) zur Untersuchung von Umweltmikroorganismen zu nutzen und einen One-Health-Rahmen zu verabschieden, um zu erfahren, wie Gesundheitsprobleme entstehen.

Introduction

Die Aquakultur ist einer der am schnellsten wachsenden lebensmittelproduzierenden Sektoren weltweit, und ihre Produktionspraktiken sollen die steigende Nachfrage nach Nahrungsmitteln für den menschlichen Verzehr befriedigen. Die weltweite Aquakulturproduktion hat sich von 34 Millionen Tonnen (Mt) im Jahr 1997 auf 112 Mt im Jahr 2017 verdreifacht¹. Die wichtigsten Artengruppen, die fast 75% der Produktion ausmachten, waren Algen, Karpfen, Muscheln, Wels und Tilapia (Oreochromis spp.) ¹. Das Auftreten von Krankheiten, die durch mikrobielle Einheiten verursacht werden, ist jedoch aufgrund der intensiven Fischzucht unvermeidlich, was zu potenziellen wirtschaftlichen Verlusten führt².

Der Einsatz von Antibiotika in der Fischzucht ist bekannt für die Vorbeugung und Behandlung bakterieller Infektionen, dem wichtigsten limitierenden Faktor für die Produktivität ^3,4. Dennoch reichern sich Restantibiotika in Aquakultursedimenten und im Wasser an, üben Selektionsdruck aus und verändern die fischassoziierten und die ansässigen Bakteriengemeinschaften 5,6,7,8. Folglich dient die Aquakulturumgebung als Reservoir für antimikrobielle Resistenzgene (ARGs) und das weitere Auftreten und die Ausbreitung antibiotikaresistenter Bakterien (ARB) im umgebenden Milieu⁹. Zusätzlich zu den bakteriellen Krankheitserregern, die häufig die Fischzuchtpraktiken beeinflussen, werden häufig Mitglieder der Enterobacteriaceae-Familie angetroffen, darunter humanpathogene Stämme von Enterobacter spp., Escherichia coli, Klebsiella spp. und Salmonella ^spp.10. E. coli ist der häufigste Mikroorganismus, der aus Fischmehl und Wasser in der Fischzucht isoliert wird 11,12,13,14,15.

E. coli ist ein vielseitiges gramnegatives Bakterium, das den Magen-Darm-Trakt von Säugetieren und Vögeln als kommensales Mitglied ihrer Darmmikrobiota bewohnt. E. coli besitzt jedoch eine sehr anpassungsfähige Fähigkeit, sich in verschiedenen Umweltnischen wie Boden, Sedimenten, Nahrung und Wasser zu besiedeln und zu persistieren¹⁶. Aufgrund des Gengewinns und -verlusts durch das Phänomen des horizontalen Gentransfers (HGT) hat sich E. coli schnell zu einem gut angepassten antibiotikaresistenten Erreger entwickelt, der in der Lage ist, ein breites Spektrum von Krankheiten bei Mensch und Tier zu verursachen^17,18. Basierend auf dem isolierten Ursprung werden pathogene Varianten als intestinale pathogene E. coli (InPEC) oder extraintestinale pathogene E. coli (ExPEC) definiert. Darüber hinaus werden InPEC und ExPEC in genau definierte Pathotypen nach Krankheitsmanifestation, genetischem Hintergrund, phänotypischen Merkmalen und Virulenzfaktoren (VFs) unterteilt16,17,19.

Traditionelle Kultur- und molekulare Techniken für pathogene E. coli-Stämme haben den schnellen Nachweis und die Identifizierung verschiedener Pathotypen ermöglicht. Sie können jedoch zeitaufwendig und mühsam sein und erfordern häufig eine hohe technische Schulung¹⁹. Darüber hinaus kann aufgrund der Komplexität ihres genetischen Hintergrunds keine einzige Methode verwendet werden, um alle pathogenen Varianten von E. coli zuverlässig zu untersuchen. Derzeit wurden diese Nachteile mit dem Aufkommen von Hochdurchsatzsequenzierungstechnologien (HTS) überwunden. Whole-Genome Sequencing (WGS) -Ansätze und bioinformatische Werkzeuge haben die Erforschung mikrobieller DNA kostengünstig und in großem Maßstab verbessert und die eingehende Charakterisierung von Mikroben in einem einzigen Durchgang erleichtert, einschließlich eng verwandter pathogener Varianten^20,21,22. Abhängig von den biologischen Fragestellungen können mehrere bioinformatische Werkzeuge, Algorithmen und Datenbanken verwendet werden, um Datenanalysen durchzuführen. Wenn das Hauptziel beispielsweise darin besteht, das Vorhandensein von ARGs, VFs und Plasmiden zu bewerten, können Tools wie ResFinder, VirulenceFinder und PlasmidFinder zusammen mit den zugehörigen Datenbanken ein guter Ausgangspunkt sein. Carriço et ^al.22 gaben einen detaillierten Überblick über die verschiedenen Bioinformatik-Software und zugehörigen Datenbanken, die für die mikrobielle WGS-Analyse eingesetzt werden, von der Vorverarbeitung von Rohdaten bis zur phylogenetischen Inferenz.

Mehrere Studien haben den breiten Nutzen von WGS für die Genomabfrage in Bezug auf antimikrobielle Resistenzattribute, pathogenes Potenzial und die Verfolgung der Entstehung und evolutionären Beziehungen klinisch relevanter Varianten von E. coli aus verschiedenen Ursprüngen gezeigt^23,24,25,26 . WGS hat die Identifizierung molekularer Mechanismen ermöglicht, die der phänotypischen Resistenz gegen Antibiotika zugrunde liegen, einschließlich dieser seltenen oder komplexen Resistenzmechanismen. Dies geschieht durch den Nachweis erworbener ARG-Varianten, neuartiger Mutationen in Wirkstoffzielgenen oder Promotorregionen^27,28. Darüber hinaus bietet WGS das Potenzial, antimikrobielle Resistenzprofile abzuleiten, ohne dass Vorkenntnisse über den Resistenzphänotyp eines Bakterienstamms erforderlich^{sind 29}. Alternativ hat WGS die Charakterisierung der mobilen genetischen Elemente (MGEs) ermöglicht, die sowohl antimikrobielle Resistenz- als auch Virulenzmerkmale aufweisen, was die bakterielle Genomevolution bestehender Krankheitserreger vorangetrieben hat. Zum Beispiel führte die Anwendung von WGS während der Untersuchung des deutschen E. coli-Ausbruchs im Jahr 2011 zur Aufdeckung der einzigartigen genomischen Merkmale eines scheinbar neuartigen E. coli-Pathotyps; Interessanterweise stammten diese Ausbruchsstämme aus der enteroaggregativen E. coli (EAEC) -Gruppe, die den Prophagen, der das Shiga-Toxin kodiert, aus dem enterohämorrhagischen E. coli (EHEC) Pathotyp³⁰ erwarb.

Diese Arbeit stellt eine methodische Anpassung des Workflows für bakterielle WGS mit einem Tischsequenzer vor. Darüber hinaus wird eine Bioinformatik-Pipeline mit webbasierten Werkzeugen bereitgestellt, um die resultierenden Sequenzen zu analysieren und Forscher mit begrenzter oder keiner bioinformatischen Expertise weiter zu unterstützen. Die beschriebenen Methoden ermöglichten die Aufklärung der antimikrobiellen Resistenz, Virulenz und Mobilommerkmale eines pathogenen E. coli-Stammes ACM5, der 2011 aus Oreochromis spp. aus Binnenzucht in Sinaloa, Mexiko^{isoliert wurde 12}.

Protocol

ANMERKUNG: Der E. coli-Stamm ACM5 wurde durch Verarbeitung und Kultivierung der Fischprobe für die Bestimmung der fäkalcoliformen (FC) gewonnen12. Während der Fischprobenahme zeigten die Fische keine klinischen Anzeichen von Krankheiten, Bakterien- oder Pilzinfektionen, und es herrschte eine Durchschnittstemperatur von 22,3 °C. Nach der Isolierung wurde das E. coli-Isolat biochemischen Tests unterzogen und kryokonserviert in Gehirnherzinfusionsbrühe (BHI) mit DMSO (8% v/v) als Kryopr…

Representative Results

Die antimikrobielle Suszeptibilität wurde durch die Scheibendiffusionsmethode bestimmt und durch CLSI-Breakpoint-Kriterien für 12 Antibiotika interpretiert, die sechs verschiedene antimikrobielle Klassen umfassen, dh Aminoglykoside, β-Lactame, Fluorchinolone, Nitrofurane, Phenicole und Folatwegsantagonisten. Das E. coli ACM5 zeigte eine Empfindlichkeit gegenüber allen Antibiotika mit Ausnahme eines β-Lactam-Arzneimittels. Vier β-Lactam-Medikamente wurden getestet: Ampicillin, Carbenicillin, Cephalothin und…

Discussion

Diese Studie stellt eine Anpassung des bakteriellen WGS-Workflows unter Verwendung eines Tischsequenzierers und einer Pipeline zur genomischen Charakterisierung einer pathogenen E. coli-Variante dar. Abhängig von der verwendeten Sequenzierungsplattform können die Durchlaufzeiten (TATs) für nasse Laborverfahren (Bakterienkultur, gDNA-Extraktion, Bibliotheksvorbereitung und Sequenzierung) und die Sequenzanalyse variieren, insbesondere wenn langsam wachsende Bakterien untersucht werden. Nach dem oben beschrieben…

Materials

Accublock Mini digital dry bath	Labnet	D0100	Dry bath for incubation of tubes
Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter	A63881	Magnetic beads in solution for DNA library purification
DeNovix DS-11	DeNovix Inc.		UV-Vis spectophotometer to check the quality of the gDNA extracted
DNA LoBind Tubes	Eppendorf	0030108418	1.5 mL PCR tubes for DNA library pooling
DynaMag-2 Magnet	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	12321D	Magnetic microtube rack used during magnetic beads-based DNA purification
Gram-negative Multibac I.D.	Diagnostic reseach (Mexico)	PT-35	Commercial standard antibiotic disks for antimicrobial susceptibility testing
MiniSeq Mid Output Kit (300-cycles)	Illumina	FC-420-1004	Reagent cartdrige for paired-end sequencing (2×150)
MiniSeq System Instrument	Illumina	SY-420-1001	Benchtop sequencer used for Next-generation sequencing
MiniSpin centrifuge	Eppendorf	5452000816	Standard centrifuge for tubes
Nextera XT DNA Library Preparation Kit	Illumina	FC-131-1024	Reagents to perform DNA libraries for sequencing. Includes Box 1 and Box 2 reagents for 24 samples
Nextera XT Index Kit v2	Illumina	FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004	Index set A, B, C, D
PhiX Control v3	Illumina	FC-110-3001	DNA library control for sequencing
Precision waterbath	LabCare America	51221081	Water bath shaker used for bacterial culture
Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	Q33231	Reagents for fluorescence-based DNA quantification assay
Qubit 2.0 Fluorometer	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	Q32866	Fluorometer used for fluorescence assay
Qubit Assay tubes	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	Q32856	0.5 mL PCR tubes for fluorescence-based DNA quantification assay
SimpliAmp Thermal Cycler	Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific	A24811	Thermocycler used for DNA library amplification
Spectronic GENESYS 10 Vis	Thermo	335900	Spectophotometer used for bacterial suspension in antimicrobial susceptibility testing
ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit	Zymo Research Inc.	D4300	Kit for genomic DNA extraction (50 preps)