אפיון זן Escherichia coli פתוגני שמקורו באוראוכרומיס spp. חוות המשתמשות בריצוף גנום שלם
Summary
ההיתכנות של אסטרטגיות ריצוף גנום שלם (WGS) באמצעות מכשירי benchtop פישטה את חקירת הגנום של כל מיקרוב בעל רלוונטיות לבריאות הציבור בסביבה מעבדתית. מתוארת התאמה מתודולוגית של זרימת העבודה עבור WGS חיידקי ומוצג גם צינור ביואינפורמטיקה לניתוח.
Abstract
חקלאות ימית היא אחד מענפי ייצור המזון הצומחים ביותר בעולם, וחקלאות האמנון (Oreochromis spp.) מהווה את זן דגי המים המתוקים העיקרי שתורבת. מאחר ששיטות חקלאות ימית רגישות לזיהום מיקרוביאלי שמקורו במקורות אנתרופוגניים, יש צורך בשימוש נרחב באנטיביוטיקה, מה שמוביל לכך שמערכות חקלאות ימית הופכות למקור חשוב של חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה ופתוגניים בעלי רלוונטיות קלינית כגון Escherichia coli (E. coli). כאן, העמידות האנטי-מיקרוביאלית, הווירוליות והתכונות הניידות של זן E. coli פתוגני, שהתאושש מאוראוכרומיס spp., שגודלו באדמה, הובהרו באמצעות ריצוף גנום שלם (WGS) ובאנליזה של סיליקו . בוצעו בדיקות רגישות מיקרוביאלית (AST) ו- WGS. יתר על כן, קבוצה פילוגנטית, סרוטיפ, הקלדת רצף מולטילוקוס (MLST), עמידות אנטי-מיקרוביאלית נרכשת, אלימות, פלסמיד ותוכן נבואה נקבעו באמצעות כלי אינטרנט זמינים מגוונים. מבודד E. coli הפגין רק רגישות ביניים לאמפיצילין ואופיין כזן ONT:H21-B1-ST40 על ידי הקלדה מבוססת WGS. אף על פי שזוהה רק גן אחד הקשור לעמידות מיקרוביאלית [mdf(A)], זוהו מספר גנים הקשורים לווירולנציה (VAGs) מהפתוטיפ האנטרופתוגני הלא טיפוסי E. coli (aEPEC). בנוסף, זוהה מטען של רפליקונים פלסמידים מקבוצות פלסמידים גדולות ו-18 אזורים הקשורים לנבואה. לסיכום, האפיון של WGS של מבודד aEPEC, שהתאושש מחוות דגים בסינלואה, מקסיקו, מאפשר תובנות לגבי הפוטנציאל הפתוגני שלו והסיכון הבריאותי האפשרי של בני אדם בצריכת מוצרים גולמיים מתחום החקלאות הימית. יש צורך לנצל את טכניקות הריצוף של הדור הבא (NGS) לחקר מיקרואורגניזמים סביבתיים ולאמץ מסגרת בריאות אחת כדי ללמוד כיצד נוצרות בעיות בריאות.
Introduction
חקלאות ימית היא אחד מענפי ייצור המזון הצומחים ביותר בעולם, ושיטות הייצור שלה נועדו לספק את הביקוש הגובר למזון לצריכה אנושית. ייצור החקלאות הימית העולמי שילש את עצמו מ-34 מיליון טון (Mt) ב-1997 ל-112 טון ב-20171. קבוצות המינים העיקריות, שתרמו לכמעט 75% מהייצור, היו אצות, קרפיונים, דו-חיים, שפמנון ואמנון (Oreochromis spp.) 1. עם זאת, הופעת מחלות הנגרמות על ידי ישויות מיקרוביאליות היא בלתי נמנעת בגלל גידול דגים אינטנסיבי, המוביל להפסדים כלכליים פוטנציאליים2.
שימוש באנטיביוטיקה בשיטות גידול דגים ידוע במניעה וטיפול בזיהומים חיידקיים, הגורם המגביל העיקרי בפרודוקטיביות 3,4. עם זאת, שאריות אנטיביוטיקה מצטברות במשקעי חקלאות ימית ובמים, מפעילות לחץ סלקטיבי ומשנות את קהילות החיידקים הקשורות לדגים ואת קהילות החיידקים השוכנות ב-5,6,7,8. כתוצאה מכך, סביבת החקלאות הימית משמשת כמאגר לגנים של עמידות מיקרוביאלית (ARGs), ולהמשך הופעתם והתפשטותם של חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה (ARB) בסביבה9. בנוסף לפתוגנים החיידקיים הנצפים בדרך כלל המשפיעים על שיטות גידול דגים, חברים ממשפחת Enterobacteriaceae נתקלים לעתים קרובות, כולל זנים פתוגניים אנושיים של Enterobacter spp., Escherichia coli, Klebsiella spp., ו סלמונלה spp.10. E. coli הוא המיקרואורגניזם הנפוץ ביותר המבודד מארוחות דגים ומים בגידול דגים 11,12,13,14,15.
E. coli הוא חיידק גראם שלילי רב-תכליתי המאכלס את מערכת העיכול של יונקים וציפורים כחבר קומנסלי במיקרוביוטה של המעיים שלהם. עם זאת, E. coli הם בעלי יכולת הסתגלות גבוהה להתיישב ולהתמיד בנישות סביבתיות שונות, כולל אדמה, משקעים, מזון ומים16. בגלל הרווח וההפסד של הגנים באמצעות תופעת העברת הגנים האופקית (HGT), E. coli התפתח במהירות לפתוגן עמיד לאנטיביוטיקה מותאם היטב, המסוגל לגרום לספקטרום רחב של מחלות בבני אדם ובבעלי חיים17,18. בהתבסס על מקור הבידוד, וריאנטים פתוגניים מוגדרים כ- E. coli פתוגני מעיים (InPEC) או E. coli פתוגני חוץ-מעיים (ExPEC). יתר על כן, InPEC ו- ExPEC מסווגים לפתוטיפים מוגדרים היטב על פי ביטוי המחלה, הרקע הגנטי, תכונות פנוטיפיות וגורמי אלימות (VFs)16,17,19.
תרבית מסורתית וטכניקות מולקולריות לזני E. coli פתוגניים אפשרו זיהוי וזיהוי מהירים של פתוטיפים שונים. עם זאת, הם עשויים להיות זמן רב, מייגע, ולעתים קרובות דורשים הכשרה טכנית גבוהה19. יתר על כן, לא ניתן להשתמש בשיטה אחת כדי לחקור באופן אמין את כל הגרסאות הפתוגניות של E. coli בגלל המורכבות של הרקע הגנטי שלהן. נכון לעכשיו, חסרונות אלה התגברו עם הופעתן של טכנולוגיות ריצוף בתפוקה גבוהה (HTS). גישות ריצוף גנום שלם (WGS) וכלים ביואינפורמטיים שיפרו את חקר הדנ”א המיקרוביאלי במחיר סביר ובקנה מידה גדול, ואפשרו אפיון מעמיק של מיקרובים בריצה אחת, כולל גרסאות פתוגניות קרובות20,21,22. בהתאם לשאלות הביולוגיות, ניתן להשתמש במספר כלי ביואינפורמטיקה, אלגוריתמים ומאגרי מידע כדי לבצע ניתוח נתונים. לדוגמה, אם המטרה העיקרית היא להעריך את הנוכחות של ARGs, VFs ופלסמידים, כלים כגון ResFinder, VirulenceFinder ו- PlasmidFinder, יחד עם מסדי הנתונים המשויכים אליהם, עשויים להיות נקודת התחלה טובה. Carriço et al.22 סיפקו סקירה מפורטת של תוכנות הביואינפורמטיקה השונות ומסדי הנתונים הקשורים המיושמים לניתוח WGS מיקרוביאלי, החל מעיבוד נתונים גולמיים וכלה בהסקה פילוגנטית.
מספר מחקרים הוכיחו את התועלת הרחבה של WGS לחקירת גנום בנוגע לתכונות עמידות מיקרוביאלית, פוטנציאל פתוגני ומעקב אחר הופעתם והקשרים האבולוציוניים של גרסאות רלוונטיות מבחינה קלינית של E. coli שמקורן במקורות מגוונים23,24,25,26 . WGS אפשרה לזהות מנגנונים מולקולריים העומדים בבסיס העמידות הפנוטיפית לאנטי-מיקרוביאלים, כולל אותם מנגנוני עמידות נדירים או מורכבים. זאת באמצעות איתור וריאנטים נרכשים של ARG, מוטציות חדשות בגנים של מטרות תרופות, או אזורים מקדמים27,28. יתר על כן, WGS מציע את הפוטנציאל להסיק פרופילי עמידות מיקרוביאלית ללא צורך בידע מוקדם על פנוטיפ העמידות של זן חיידקי29. לחלופין, WGS אפשרה לאפיין את האלמנטים הגנטיים הניידים (MGEs) הנושאים הן עמידות מיקרוביאלית והן תכונות של אלימות, מה שהניע את התפתחות הגנום החיידקי של פתוגנים קיימים. לדוגמה, היישום של WGS במהלך חקירת התפרצות E. coli הגרמנית בשנת 2011 הביא לחשיפת המאפיינים הגנומיים הייחודיים של פתוטיפ E. coli חדשני לכאורה; באופן מעניין, זני התפרצות אלה מקורם בקבוצת E. coli האנטרוגרגטיבית (EAEC), שרכשה את הנבואה המקודדת את רעלן שיגה מהפתוטיפ E. coli (EHEC) האנטרוהמורגי30.
עבודה זו מציגה התאמה מתודולוגית של זרימת העבודה עבור WGS חיידקי באמצעות רצף benchtop. יתר על כן, צינור ביואינפורמטיקה מסופק באמצעות כלים מבוססי אינטרנט כדי לנתח את הרצפים המתקבלים ולתמוך עוד יותר בחוקרים עם מומחיות מוגבלת או ללא מומחיות בביואינפורמטיקה. השיטות המתוארות אפשרו להבהיר את העמידות האנטי-מיקרוביאלית, הווירוליות והתכונות הניידות של זן E. coli פתוגני ACM5, שבודד בשנת 2011 מאוראוכרומיס spp. שגודל בפנים הארץ בסינלואה, מקסיקו12.
Protocol
Representative Results
Discussion
מחקר זה מציג התאמה של זרימת העבודה של חיידקי WGS באמצעות רצף ספסל וצינור לאפיון גנומי של וריאנט E. coli פתוגני. בהתאם לפלטפורמת הריצוף שבה נעשה שימוש, זמני ההסבה (TATs) עבור הליכי מעבדה רטובים (גידול חיידקים, מיצוי gDNA, הכנת ספרייה וריצוף) וניתוח רצפים עשויים להשתנות, במיוחד אם נחקרים חיידקים ש…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
למועצה הלאומית למדע וטכנולוגיה של מקסיקו (CONACyT בראשי התיבות שלה בספרדית) עבור מלגת הדוקטורט שהוענקה לחוסה אנטוניו מאגניה-ליזאראגה [מס’ 481143].
Materials
| Accublock Mini digital dry bath | Labnet | D0100 | Dry bath for incubation of tubes |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic beads in solution for DNA library purification |
| DeNovix DS-11 | DeNovix Inc. | UV-Vis spectophotometer to check the quality of the gDNA extracted | |
| DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 0030108418 | 1.5 mL PCR tubes for DNA library pooling |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 12321D | Magnetic microtube rack used during magnetic beads-based DNA purification |
| Gram-negative Multibac I.D. | Diagnostic reseach (Mexico) | PT-35 | Commercial standard antibiotic disks for antimicrobial susceptibility testing |
| MiniSeq Mid Output Kit (300-cycles) | Illumina | FC-420-1004 | Reagent cartdrige for paired-end sequencing (2×150) |
| MiniSeq System Instrument | Illumina | SY-420-1001 | Benchtop sequencer used for Next-generation sequencing |
| MiniSpin centrifuge | Eppendorf | 5452000816 | Standard centrifuge for tubes |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina | FC-131-1024 | Reagents to perform DNA libraries for sequencing. Includes Box 1 and Box 2 reagents for 24 samples |
| Nextera XT Index Kit v2 | Illumina | FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004 | Index set A, B, C, D |
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | DNA library control for sequencing |
| Precision waterbath | LabCare America | 51221081 | Water bath shaker used for bacterial culture |
| Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Q33231 | Reagents for fluorescence-based DNA quantification assay |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Q32866 | Fluorometer used for fluorescence assay |
| Qubit Assay tubes | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Q32856 | 0.5 mL PCR tubes for fluorescence-based DNA quantification assay |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific | A24811 | Thermocycler used for DNA library amplification |
| Spectronic GENESYS 10 Vis | Thermo | 335900 | Spectophotometer used for bacterial suspension in antimicrobial susceptibility testing |
| ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit | Zymo Research Inc. | D4300 | Kit for genomic DNA extraction (50 preps) |
Referências
- Naylor, R. L., et al. A 20-year retrospective review of global aquaculture. Nature. 591 (7851), 551-563 (2021).
- Quesada, S. P., Paschoal, J. A. R., Reyes, F. G. R. Considerations on the aquaculture development and on the use of veterinary drugs: special issue for fluoroquinolones-a review. Journal of Food Science. 78 (9), 1321-1333 (2013).
- Defoirdt, T., Sorgeloos, P., Bossier, P. Alternatives to antibiotics for the control of bacterial disease in aquaculture. Current Opinion in Microbiology. 14 (3), 251-258 (2011).
- Stentiford, G. D., et al. New paradigms to help solve the global aquaculture disease crisis. PLOS Pathogens. 13 (2), 1006160 (2017).
- Chen, H., et al. Tissue distribution, bioaccumulation characteristics and health risk of antibiotics in cultured fish from a typical aquaculture area. Journal of Hazardous Materials. 343, 140-148 (2018).
- Zhou, M., et al. Antibiotics control in aquaculture requires more than antibiotic-free feeds: A Tilapia farming case. Environmental Pollution. 268, 115854 (2021).
- Feng, Y., et al. Ecological effects of antibiotics on aquaculture ecosystems based on microbial community in sediments. Ocean & Coastal Management. 224, 106173 (2022).
- Shen, X., Jin, G., Zhao, Y., Shao, X. Prevalence and distribution analysis of antibiotic resistance genes in a large-scale aquaculture environment. Science of The Total Environment. 711, 134626 (2020).
- Su, H., et al. Contamination of antibiotic resistance genes (ARGs) in a typical marine aquaculture farm: source tracking of ARGs in reared aquatic organisms. Journal of Environmental Science and Health, Part B. 55 (3), 220-229 (2020).
- Oliveira, R. V., Oliveira, M. C., Pelli, A. Disease infection by Enterobacteriaceae family in fishes: a review. Journal of Microbiology & Experimentation. 4 (5), 00128 (2017).
- Barbosa, M. M. C., et al. Sorologia e suscetibilidade antimicrobiana em isolados de Escherichia coli de pesque-pagues. Arquivos do Instituto Biológico. 81 (1), 43-48 (2014).
- Valenzuela-Armenta, J. A., et al. Microbiological analysis of Tilapia and water in aquaculture farms from Sinaloa. Biotecnia. 20 (1), 20-26 (2018).
- Reza, R. H., Shipa, S. A., Naser, M. N., Miah, M. F. Surveillance of Escherichia coli in a fish farm of Sylhet, Bangladesh. Bangladesh Journal of Zoology. 48 (2), 335-346 (2021).
- Liao, C. -. Y., et al. Antimicrobial resistance of Escherichia coli From aquaculture farms and their environment in Zhanjiang, China. Frontiers in Veterinary Science. 8, 806653 (2021).
- Dewi, R. R., et al. Prevalence and antimicrobial resistance of Escherichia coli, Salmonella and Vibrio derived from farm-raised Red Hybrid Tilapia (Oreochromis spp.) and Asian Sea Bass (Lates calcarifer, Bloch 1970) on the west coast of Peninsular Malaysia. Antibiotics. 11 (2), 136 (2022).
- Leimbach, A., Hacker, J., Dobrindt, U. E. coli as an all-rounder: the thin line between commensalism and pathogenicity. Current Topics in Microbiology and Immunology. 358, 3-32 (2013).
- Kaper, J. B., Nataro, J. P., Mobley, H. L. T. Pathogenic Escherichia coli. Nature Reviews Microbiology. 2 (2), 123-140 (2004).
- Croxen, M. A., Finlay, B. B. Molecular mechanisms of Escherichia coli pathogenicity. Nature Reviews Microbiology. 8 (1), 26-38 (2010).
- Croxen, M. A., et al. Recent advances in understanding enteric pathogenic Escherichia coli. Clinical Microbiology Reviews. 26 (4), 822-880 (2013).
- Bertelli, C., Greub, G. Rapid bacterial genome sequencing: methods and applications in clinical microbiology. Clinical Microbiology and Infection. 19 (9), 803-813 (2013).
- Lynch, T., Petkau, A., Knox, N., Graham, M., Van Domselaar, G. A primer on infectious disease bacterial genomics. Clinical Microbiology Reviews. 29 (4), 881-913 (2016).
- Carriço, J. A., Rossi, M., Moran-Gilad, J., Van Domselaar, G., Ramirez, M. A primer on microbial bioinformatics for nonbioinformaticians. Clinical Microbiology and Infection. 24 (4), 342-349 (2018).
- Magaña-Lizárraga, J. A., et al. Draft genome sequence of Escherichia coli M51-3: a multidrug-resistant strain assigned as ST131-H30 recovered from infant diarrheal infection in Mexico. Journal of Global Antimicrobial Resistance. 19, 311-312 (2019).
- Pérez-Vázquez, M., et al. Emergence of NDM-producing Klebsiella pneumoniae and Escherichia coli in Spain: phylogeny, resistome, virulence and plasmids encoding blaNDM-like genes as determined by WGS. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 74 (12), 3489-3496 (2019).
- Massella, E., et al. Snapshot study of whole genome sequences of Escherichia coli from healthy companion animals, livestock, wildlife, humans and food in Italy. Antibiotics. 9 (11), 782 (2020).
- Magaña-Lizárraga, J. A., et al. Genomic profiling of antibiotic-resistant Escherichia coli isolates from surface water of agricultural drainage in north-western Mexico: detection of the international high-risk lineages ST410 and ST617. Microorganisms. 10 (3), 662 (2022).
- Saracino, I. M., et al. Next Generation sequencing for the prediction of the antibiotic resistance in Helicobacter pylori: a literature review. Antibiotics. 10 (4), 437 (2021).
- Ghosh, A., Saha, S. Survey of drug resistance associated gene mutations in Mycobacterium tuberculosis, ESKAPE and other bacterial species. Scientific Reports. 10 (1), 8957 (2020).
- Su, M., Satola, S. W., Read, T. D. Genome-based prediction of bacterial antibiotic resistance. Journal of Clinical Microbiology. 57 (3), 01405-01418 (2019).
- Brzuszkiewicz, E., et al. Genome sequence analyses of two isolates from the recent Escherichia coli outbreak in Germany reveal the emergence of a new pathotype: Entero-Aggregative-Haemorrhagic Escherichia coli (EAHEC). Archives of Microbiology. 193 (12), 883-891 (2011).
- . CLSI Performance Standards for Antimicrobial Disk Susceptibility Tests. 13th ed. CLSI standard M02. Wayne, PA: Clinical and Laboratory Standards Institute Available from: https://clsi.org/standards/products/microbiology/documents/m02/ (2018)
- CLSI Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing. 31st ed. CLSI supplement M100. Clinical and Laboratory Standards Institute Available from: https://clsi.org/standards/products/microbiology/documents/m100/ (2021)
- Ewing, B., Green, P. Base-calling of automated sequencer traces using phred. II. Error probabilities. Genome Research. 8 (3), 186-194 (1998).
- Quainoo, S., et al. Whole-genome sequencing of bacterial pathogens: the future of nosocomial outbreak analysis. Clinical Microbiology Reviews. 30 (4), 1015-1063 (2017).
- Desai, A., et al. Identification of optimum sequencing depth especially for de novo genome assembly of small genomes using next generation sequencing data. PLoS ONE. 8 (4), 60204 (2013).
- Nishino, K., Yamada, J., Hirakawa, H., Hirata, T., Yamaguchi, A. Roles of TolC-dependent multidrug transporters of Escherichia coli in resistance to β-lactams. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 47 (9), 3030-3033 (2003).
- Li, M., et al. The resistance mechanism of Escherichia coli induced by ampicillin in laboratory. Infection and Drug Resistance. 12, 2853-2863 (2019).
- Ménard, L. -. P., Dubreuil, J. D. Enteroaggregative Escherichia coli heat-stable enterotoxin 1 (EAST1): a new toxin with an old twist. Critical Reviews in Microbiology. 28 (1), 43-60 (2002).
- Dubreuil, J. D. EAST1 toxin: An enigmatic molecule associated with sporadic episodes of diarrhea in humans and animals. Journal of Microbiology. 57 (7), 541-549 (2019).
- Goldstein, S., Beka, L., Graf, J., Klassen, J. L. Evaluation of strategies for the assembly of diverse bacterial genomes using MinION long-read sequencing. BMC Genomics. 20 (1), 23 (2019).
- Guerrero, A., Gomez-Gil, B., Lizarraga-Partida, M. L. Genomic stability among O3:K6 V. parahaemolyticus pandemic strains isolated between 1996 to 2012 in American countries. BMC Genomic Data. 22 (1), 38 (2021).
- FAO Applications of Whole Genome Sequencing (WGS) in food safety management. Food and Agriculture Organization of the United Nations Available from: https://www.fao.org/documents/card/es/c/61e44b34-b328-4239-b59c-a9e926e327b4/ (2016)
- Rantsiou, K., et al. Next generation microbiological risk assessment: opportunities of whole genome sequencing (WGS) for foodborne pathogen surveillance, source tracking and risk assessment. International Journal of Food Microbiology. 287, 3-9 (2018).
