Karakterisering av en patogen Escherichia coli-stamme avledet fra Oreochromis spp. Gårder ved bruk av helgenomsekvensering

Summary

Gjennomførbarheten av helgenomsekvenseringsstrategier (WGS) ved hjelp av stasjonære instrumenter har forenklet genomundersøkelsen av hver mikrobe av folkehelserelevans i en laboratorieinnstilling. En metodologisk tilpasning av arbeidsflyten for bakteriell WGS er beskrevet og en bioinformatikk rørledning for analyse er også presentert.

Abstract

Akvakultur er en av de raskest voksende matproduserende sektorene over hele verden, og tilapia (Oreochromis spp.) oppdrett utgjør den store ferskvannsfisksorten som dyrkes. Fordi akvakulturpraksis er utsatt for mikrobiell forurensning avledet fra menneskeskapte kilder, er det nødvendig med omfattende antibiotikabruk, noe som fører til at akvakultursystemer blir en viktig kilde til antibiotikaresistente og patogene bakterier av klinisk relevans som Escherichia coli (E. coli). Her ble den antimikrobielle resistensen, virulensen og mobilomegenskapene til en patogen E. coli-stamme , gjenfunnet fra innlandsoppdrettet Oreochromis spp., belyst gjennom helgenomsekvensering (WGS) og i silico-analyse . Antimikrobiell følsomhetstesting (ASAT) og WGS ble utført. Videre ble fylogenetisk gruppe, serotype, multilokussekvenstyping (MLST), ervervet antimikrobiell resistens, virulens, plasmid og profaginnhold bestemt ved hjelp av forskjellige tilgjengelige webverktøy. E. coli-isolatet viste bare mellomliggende følsomhet for ampicillin og ble karakterisert som ONT: H21-B1-ST40-stamme ved WGS-basert skriving. Selv om bare et enkelt antimikrobielt resistensrelatert gen ble detektert [mdf (A)], ble flere virulensassosierte gener (VAGs) fra den atypiske enteropatogene E. coli (aEPEC) patotypen identifisert. I tillegg ble lasten av plasmidreplikoner fra store plasmidgrupper og 18 profagassosierte regioner oppdaget. Avslutningsvis gir WGS-karakteriseringen av et aEPEC-isolat, gjenvunnet fra et oppdrettsanlegg i Sinaloa, Mexico, innsikt i dets patogene potensial og den mulige helserisikoen ved å konsumere rå akvakulturprodukter. Det er nødvendig å utnytte neste generasjons sekvenseringsteknikker (NGS) for å studere miljømikroorganismer og å vedta et helseramme for å lære hvordan helseproblemer oppstår.

Introduction

Akvakultur er en av de raskest voksende matproduserende sektorene over hele verden, og produksjonspraksis er ment å tilfredsstille den økende etterspørselen etter mat til konsum. Den globale akvakulturproduksjonen er tredoblet fra 34 millioner tonn (Mt) i 1997 til 112 Mt i 2017¹. De viktigste artsgruppene, som bidro til nesten 75% av produksjonen, var tang, karpe, muslinger, steinbit og tilapia (Oreochromis spp.) ¹. Utseendet til sykdommer forårsaket av mikrobielle enheter er imidlertid uunngåelig på grunn av intensivt oppdrett, noe som fører til potensielle økonomiske tap².

Antibiotikabruk i oppdrettspraksis er kjent for å forebygge og behandle bakterielle infeksjoner, den viktigste begrensende faktoren i produktivitet ^3,4. Ikke desto mindre akkumuleres resterende antibiotika i akvakultursedimenter og vann, utøver selektivt trykk og modifiserer de fiskeassosierte og de bosatte bakteriesamfunnene 5,6,7,8. Følgelig fungerer oppdrettsmiljøet som et reservoar for antimikrobielle resistensgener (ARGs), og videre fremvekst og spredning av antibiotikaresistente bakterier (ARB) i det omkringliggende miljøet⁹. I tillegg til de bakterielle patogenene som ofte observeres som påvirker oppdrettspraksis, oppstår ofte medlemmer av Enterobacteriaceae-familien, inkludert humane patogenstammer av Enterobacter spp., Escherichia coli, Klebsiella spp., og Salmonella spp.10. E. coli er den vanligste mikroorganismen isolert fra fiskemel og vann i fiskeoppdrett 11,12,13,14,15.

E. coli er en allsidig gram-negativ bakterie som bor i mage-tarmkanalen hos pattedyr og fugler som et kommensalt medlem av deres tarmmikrobiota. Imidlertid har E. coli en svært adaptiv kapasitet til å kolonisere og vedvare i forskjellige miljønisjer, inkludert jord, sedimenter, mat og vann¹⁶. På grunn av gengevinst og tap gjennom fenomenet horisontal genoverføring (HGT), har E. coli raskt utviklet seg til et godt tilpasset antibiotikaresistent patogen, som kan forårsake et bredt spekter av sykdommer hos mennesker og dyr^17,18. Basert på isolasjonsopprinnelsen defineres patogene varianter som tarmpatogen E. coli (InPEC) eller ekstra-intestinal patogen E. coli (ExPEC). Videre er InPEC og ExPEC subklassifisert i veldefinerte patotyper i henhold til sykdomsmanifestasjon, genetisk bakgrunn, fenotypiske egenskaper og virulensfaktorer (VF)^16,17,19.

Tradisjonell kultur og molekylære teknikker for patogene E. coli-stammer har gjort det mulig å raskt oppdage og identifisere forskjellige patotyper. Imidlertid kan de være tidkrevende, arbeidskrevende og krever ofte høy teknisk opplæring¹⁹. Videre kan ingen enkelt metode brukes til å studere alle patogene varianter av E. coli på en pålitelig måte på grunn av kompleksiteten i deres genetiske bakgrunn. For tiden har disse ulempene blitt overvunnet med fremkomsten av HTS-teknologier (High Throughput Sequencing). Helgenomsekvensering (WGS) tilnærminger og bioinformatiske verktøy har forbedret utforskningen av mikrobielt DNA rimelig og i stor skala, noe som letter den grundige karakteriseringen av mikrober i en enkelt kjøring, inkludert nært beslektede patogene varianter^20,21,22. Avhengig av de biologiske spørsmålene, kan flere bioinformatikkverktøy, algoritmer og databaser brukes til å utføre dataanalyse. For eksempel, hvis hovedmålet er å vurdere tilstedeværelsen av ARGs, VFs og plasmider, kan verktøy som ResFinder, VirulenceFinder og PlasmidFinder, sammen med tilhørende databaser, være et godt utgangspunkt. Carriço et ^al.22 ga en detaljert oversikt over de forskjellige bioinformatikkprogramvarene og relaterte databaser som ble brukt for mikrobiell WGS-analyse, fra rådataforbehandling til fylogenetisk inferens.

Flere studier har vist den brede nytten av WGS for genomundersøkelse angående antimikrobielle resistensattributter, patogent potensial og sporing av fremveksten og evolusjonære forhold mellom klinisk relevante varianter av E. coli hentet fra forskjellige opprinnelser^23,24,25,26 . WGS har gjort det mulig å identifisere molekylære mekanismer som ligger til grunn for fenotypisk resistens mot antimikrobielle midler, inkludert de sjeldne eller komplekse resistensmekanismene. Dette er gjennom å oppdage ervervede ARG-varianter, nye mutasjoner i legemiddelmålgener eller promotorregioner^27,28. Videre tilbyr WGS potensialet til å utlede antimikrobielle resistensprofiler uten å kreve forkunnskaper om resistensfenotypen til en bakteriestamme²⁹. Alternativt har WGS tillatt karakterisering av de mobile genetiske elementene (MGE) som bærer både antimikrobiell resistens og virulensegenskaper, noe som har drevet bakteriell genomutvikling av eksisterende patogener. For eksempel resulterte anvendelsen av WGS under undersøkelsen av det tyske E. coli-utbruddet i 2011 i å avdekke de unike genomiske egenskapene til en tilsynelatende ny E. coli-patotype; interessant nok stammer disse utbruddsstammene fra den enteroaggregerende E. coli (EAEC) -gruppen, som kjøpte prophage-kodingen av Shiga-toksinet fra den enterohemoragiske E. coli (EHEC) patotypen³⁰.

Dette arbeidet presenterer en metodisk tilpasning av arbeidsflyten for bakteriell WGS ved hjelp av en benchtop sequencer. Videre tilbys en bioinformatikk-rørledning ved hjelp av nettbaserte verktøy for å analysere de resulterende sekvensene og ytterligere støtte forskere med begrenset eller ingen bioinformatikkkompetanse. De beskrevne metodene tillot belysning av antimikrobiell resistens, virulens og mobilomegenskaper av en patogen E. coli-stamme ACM5, isolert i 2011 fra innlandet oppdrettet Oreochromis spp. i Sinaloa, Mexico¹².

Protocol

MERK: E. coli-stammen ACM5 ble gjenfunnet ved bearbeiding og dyrking av fiskeprøven for fekal koliform (FC) bestemmelse12. Under prøvetakingen viste fisken ikke kliniske tegn på sykdom, bakterie- eller soppinfeksjon, og gjennomsnittstemperatur på 22,3 °C hersket. Etter isolering ble E. coli-isolatet utsatt for biokjemisk testing og kryopreservert i hjernehjerteinfusjon (BHI) buljong med DMSO (8% v / v) som kryobeskyttende middel. 1. Reaktive…

Representative Results

Den antimikrobielle følsomheten ble bestemt ved diskdiffusjonsmetoden og tolket av CLSI-brytningskriterier for 12 antibiotika som spenner over seks forskjellige antimikrobielle klasser, det vil si aminoglykosider, β-laktamer, fluorokinoloner, nitrofuraner, fenoler og folatveiantagonister. E. coli ACM5 viste følsomhet overfor alle antibiotika unntatt ett β-laktammedikament. Fire β-laktammedikamenter ble testet: ampicillin, karbenicillin, cefalotin og cefotaksim. Blant disse ble det målt en 14 mm hemmingshal…

Discussion

Denne studien presenterer en tilpasning av den bakterielle WGS-arbeidsflyten ved hjelp av en benchtop sequencer og en rørledning for genomisk karakterisering av en patogen E. coli-variant. Avhengig av sekvenseringsplattformen som brukes, kan behandlingstidene (TATs) for våte laboratorieprosedyrer (bakteriell dyrking, gDNA-ekstraksjon, bibliotekpreparasjon og sekvensering) og sekvensanalyse variere, spesielt hvis sakte voksende bakterier studeres. Etter protokollen for WGS beskrevet ovenfor var TAT innen 4 dage…

Materials

Accublock Mini digital dry bath	Labnet	D0100	Dry bath for incubation of tubes
Agencourt AMPure XP	Beckman Coulter	A63881	Magnetic beads in solution for DNA library purification
DeNovix DS-11	DeNovix Inc.		UV-Vis spectophotometer to check the quality of the gDNA extracted
DNA LoBind Tubes	Eppendorf	0030108418	1.5 mL PCR tubes for DNA library pooling
DynaMag-2 Magnet	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	12321D	Magnetic microtube rack used during magnetic beads-based DNA purification
Gram-negative Multibac I.D.	Diagnostic reseach (Mexico)	PT-35	Commercial standard antibiotic disks for antimicrobial susceptibility testing
MiniSeq Mid Output Kit (300-cycles)	Illumina	FC-420-1004	Reagent cartdrige for paired-end sequencing (2×150)
MiniSeq System Instrument	Illumina	SY-420-1001	Benchtop sequencer used for Next-generation sequencing
MiniSpin centrifuge	Eppendorf	5452000816	Standard centrifuge for tubes
Nextera XT DNA Library Preparation Kit	Illumina	FC-131-1024	Reagents to perform DNA libraries for sequencing. Includes Box 1 and Box 2 reagents for 24 samples
Nextera XT Index Kit v2	Illumina	FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004	Index set A, B, C, D
PhiX Control v3	Illumina	FC-110-3001	DNA library control for sequencing
Precision waterbath	LabCare America	51221081	Water bath shaker used for bacterial culture
Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	Q33231	Reagents for fluorescence-based DNA quantification assay
Qubit 2.0 Fluorometer	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	Q32866	Fluorometer used for fluorescence assay
Qubit Assay tubes	Invitrogen, Thermo Fisher Scientific	Q32856	0.5 mL PCR tubes for fluorescence-based DNA quantification assay
SimpliAmp Thermal Cycler	Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific	A24811	Thermocycler used for DNA library amplification
Spectronic GENESYS 10 Vis	Thermo	335900	Spectophotometer used for bacterial suspension in antimicrobial susceptibility testing
ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit	Zymo Research Inc.	D4300	Kit for genomic DNA extraction (50 preps)