Caracterización de una cepa patógena de Escherichia coli derivada de granjas de Oreochromis spp.
Summary
La viabilidad de las estrategias de secuenciación del genoma completo (WGS) utilizando instrumentos de sobremesa ha simplificado la interrogación del genoma de cada microbio de relevancia para la salud pública en un entorno de laboratorio. Se describe una adaptación metodológica del flujo de trabajo para WGS bacteriano y también se presenta una tubería bioinformática para el análisis.
Abstract
La acuicultura es uno de los sectores productores de alimentos de más rápido crecimiento en todo el mundo y el cultivo de tilapia (Oreochromis spp.) constituye la principal variedad de peces de agua dulce cultivada. Debido a que las prácticas acuícolas son susceptibles a la contaminación microbiana derivada de fuentes antropogénicas, se necesita un uso extensivo de antibióticos, lo que lleva a que los sistemas acuícolas se conviertan en una fuente importante de bacterias patógenas y resistentes a los antibióticos de relevancia clínica como Escherichia coli (E. coli). Aquí, la resistencia antimicrobiana, la virulencia y las características del mobiloma de una cepa patógena de E. coli , recuperada de Oreochromis spp. cultivada en el interior, se dilucidaron mediante secuenciación del genoma completo (WGS) y análisis in silico . Se realizaron pruebas de sensibilidad antimicrobiana (AST) y WGS. Además, el grupo filogenético, el serotipo, la tipificación de secuencias multilocus (MLST), la resistencia antimicrobiana adquirida, la virulencia, el plásmido y el contenido de profagos se determinaron utilizando diversas herramientas web disponibles. El aislado de E. coli solo exhibió susceptibilidad intermedia a la ampicilina y se caracterizó como cepa ONT: H21-B1-ST40 por tipificación basada en WGS. Aunque solo se detectó un único gen relacionado con la resistencia a los antimicrobianos [mdf(A)], se identificaron varios genes asociados a la virulencia (VAG) del patotipo enteropatógeno atípico de E. coli (aEPEC). Además, se detectó la carga de replicones plásmidos de grandes grupos plásmidos y 18 regiones asociadas a profagos. En conclusión, la caracterización WGS de un aislado aEPEC, recuperado de una piscifactoría en Sinaloa, México, permite conocer su potencial patogénico y el posible riesgo para la salud humana de consumir productos acuícolas crudos. Es necesario explotar las técnicas de secuenciación de próxima generación (NGS) para estudiar los microorganismos ambientales y adoptar un marco de salud única para aprender cómo se originan los problemas de salud.
Introduction
La acuicultura es uno de los sectores productores de alimentos de más rápido crecimiento en todo el mundo, y sus prácticas de producción están destinadas a satisfacer la creciente demanda de alimentos para el consumo humano. La producción acuícola mundial se ha triplicado de 34 millones de toneladas (Mt) en 1997 a 112 Mt en 20171. Los principales grupos de especies, que contribuyeron a casi el 75% de la producción, fueron algas, carpas, bivalvos, bagres y tilapia (Oreochromis spp.) 1. Sin embargo, la aparición de enfermedades causadas por entidades microbianas es inevitable debido a la piscicultura intensiva, lo que lleva a posibles pérdidas económicas2.
El uso de antibióticos en las prácticas de piscicultura es bien conocido por prevenir y tratar infecciones bacterianas, el principal factor limitante en la productividad 3,4. Sin embargo, los antibióticos residuales se acumulan en los sedimentos y el agua de la acuicultura, ejerciendo una presión selectiva y modificando las comunidades bacterianas asociadas a los peces y residentes 5,6,7,8. En consecuencia, el ambiente acuícola sirve como reservorio para los genes de resistencia a los antimicrobianos (ARG), y la posterior aparición y propagación de bacterias resistentes a los antibióticos (ARB) en el medio circundante9. Además de los patógenos bacterianos comúnmente observados que afectan las prácticas de piscicultura, a menudo se encuentran miembros de la familia Enterobacteriaceae, incluidas cepas de patógenos humanos de Enterobacter spp., Escherichia coli, Klebsiella spp. y Salmonella spp.10. E. coli es el microorganismo más común aislado de la harina y el agua de pescado en la piscicultura 11,12,13,14,15.
E. coli es una bacteria gramnegativa versátil que habita en el tracto gastrointestinal de mamíferos y aves como miembro comensal de su microbiota intestinal. Sin embargo, E. coli posee una alta capacidad adaptativa para colonizar y persistir en diferentes nichos ambientales, incluyendo suelo, sedimentos, alimentos y agua16. Debido a la ganancia y pérdida de genes a través del fenómeno de transferencia horizontal de genes (HGT), E. coli ha evolucionado rápidamente hasta convertirse en un patógeno resistente a los antibióticos bien adaptado, capaz de causar un amplio espectro de enfermedades en humanos y animales17,18. Según el origen del aislamiento, las variantes patogénicas se definen como E. coli patógena intestinal (InPEC) o E. coli patógena extraintestinal (ExPEC). Además, InPEC y ExPEC se subclasifican en patotipos bien definidos de acuerdo con la manifestación de la enfermedad, los antecedentes genéticos, los rasgos fenotípicos y los factores de virulencia (FV)16,17,19.
El cultivo tradicional y las técnicas moleculares para cepas patógenas de E. coli han permitido la rápida detección e identificación de diferentes patotipos. Sin embargo, pueden llevar mucho tiempo, ser laboriosas y con frecuencia requieren una alta capacitación técnica19. Además, no se puede utilizar un método único para estudiar de manera confiable todas las variantes patogénicas de E. coli debido a la complejidad de sus antecedentes genéticos. Actualmente, estos inconvenientes se han superado con el advenimiento de las tecnologías de secuenciación de alto rendimiento (HTS). Los enfoques de secuenciación del genoma completo (WGS) y las herramientas bioinformáticas han mejorado la exploración del ADN microbiano de manera asequible y a gran escala, facilitando la caracterización en profundidad de los microbios en una sola ejecución, incluidas las variantes patogénicas estrechamente relacionadas20,21,22. Dependiendo de las preguntas biológicas, se pueden utilizar varias herramientas bioinformáticas, algoritmos y bases de datos para realizar análisis de datos. Por ejemplo, si el objetivo principal es evaluar la presencia de ARG, VF y plásmidos, herramientas como ResFinder, VirulenceFinder y PlasmidFinder, junto con sus bases de datos asociadas, podrían ser un buen punto de partida. Carriço et al.22 proporcionaron una visión detallada de los diferentes programas informáticos y bases de datos relacionadas aplicadas para el análisis microbiano de WGS, desde el preprocesamiento de datos brutos hasta la inferencia filogenética.
Varios estudios han demostrado la amplia utilidad de WGS para la interrogación del genoma con respecto a los atributos de resistencia a los antimicrobianos, el potencial patogénico y el seguimiento de la aparición y las relaciones evolutivas de variantes clínicamente relevantes de E. coli procedentes de diversos orígenes23,24,25,26 . WGS ha permitido la identificación de los mecanismos moleculares subyacentes a la resistencia fenotípica a los antimicrobianos, incluidos los mecanismos de resistencia raros o complejos. Esto es a través de la detección de variantes ARG adquiridas, mutaciones novedosas en genes diana de fármacos o regiones promotoras27,28. Además, WGS ofrece el potencial de inferir perfiles de resistencia antimicrobiana sin requerir conocimientos previos sobre el fenotipo de resistencia de una cepa bacteriana29. Alternativamente, WGS ha permitido la caracterización de los elementos genéticos móviles (MGE) portadores de características de resistencia antimicrobiana y virulencia, lo que ha impulsado la evolución del genoma bacteriano de los patógenos existentes. Por ejemplo, la aplicación de WGS durante la investigación del brote alemán de E. coli en 2011 resultó en el descubrimiento de las características genómicas únicas de un patotipo de E. coli aparentemente nuevo; Curiosamente, esas cepas del brote se originaron en el grupo enteroagregativo de E. coli (EAEC), que adquirió el profago que codifica la toxina Shiga del patotipo30 enterohemorrágico de E. coli (EHEC).
Este trabajo presenta una adaptación metodológica del flujo de trabajo para WGS bacteriano utilizando un secuenciador de sobremesa. Además, se proporciona una tubería de bioinformática utilizando herramientas basadas en la web para analizar las secuencias resultantes y apoyar aún más a los investigadores con experiencia limitada o nula en bioinformática. Los métodos descritos permitieron dilucidar la resistencia antimicrobiana, la virulencia y las características del mobiloma de una cepa patógena de E. coli ACM5, aislada en 2011 de Oreochromis spp. cultivada en el interior en Sinaloa, México12.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este estudio presenta una adaptación del flujo de trabajo bacteriano de WGS utilizando un secuenciador de sobremesa y una tubería para la caracterización genómica de una variante patógena de E. coli. Dependiendo de la plataforma de secuenciación utilizada, los tiempos de respuesta (ATT) para procedimientos de laboratorio húmedos (cultivo bacteriano, extracción de ADNg, preparación de bibliotecas y secuenciación) y análisis de secuencias podrían variar, particularmente si se estudian bacterias de crec…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología de México (CONACyT) por la beca de doctorado otorgada a José Antonio Magaña-Lizárraga [No. 481143].
Materials
| Accublock Mini digital dry bath | Labnet | D0100 | Dry bath for incubation of tubes |
| Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 | Magnetic beads in solution for DNA library purification |
| DeNovix DS-11 | DeNovix Inc. | UV-Vis spectophotometer to check the quality of the gDNA extracted | |
| DNA LoBind Tubes | Eppendorf | 0030108418 | 1.5 mL PCR tubes for DNA library pooling |
| DynaMag-2 Magnet | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | 12321D | Magnetic microtube rack used during magnetic beads-based DNA purification |
| Gram-negative Multibac I.D. | Diagnostic reseach (Mexico) | PT-35 | Commercial standard antibiotic disks for antimicrobial susceptibility testing |
| MiniSeq Mid Output Kit (300-cycles) | Illumina | FC-420-1004 | Reagent cartdrige for paired-end sequencing (2×150) |
| MiniSeq System Instrument | Illumina | SY-420-1001 | Benchtop sequencer used for Next-generation sequencing |
| MiniSpin centrifuge | Eppendorf | 5452000816 | Standard centrifuge for tubes |
| Nextera XT DNA Library Preparation Kit | Illumina | FC-131-1024 | Reagents to perform DNA libraries for sequencing. Includes Box 1 and Box 2 reagents for 24 samples |
| Nextera XT Index Kit v2 | Illumina | FC-131-2001, FC-131-2002, FC-131-2003, FC-131-2004 | Index set A, B, C, D |
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 | DNA library control for sequencing |
| Precision waterbath | LabCare America | 51221081 | Water bath shaker used for bacterial culture |
| Qubit 1X dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Q33231 | Reagents for fluorescence-based DNA quantification assay |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Q32866 | Fluorometer used for fluorescence assay |
| Qubit Assay tubes | Invitrogen, Thermo Fisher Scientific | Q32856 | 0.5 mL PCR tubes for fluorescence-based DNA quantification assay |
| SimpliAmp Thermal Cycler | Applied Biosystems, Thermo Fisher Scientific | A24811 | Thermocycler used for DNA library amplification |
| Spectronic GENESYS 10 Vis | Thermo | 335900 | Spectophotometer used for bacterial suspension in antimicrobial susceptibility testing |
| ZymoBIOMICS DNA Miniprep Kit | Zymo Research Inc. | D4300 | Kit for genomic DNA extraction (50 preps) |
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