Summary
Er werd een lichtplaatmicroscoop ontwikkeld om het hele slakkenhuis in beeld te brengen en te digitaliseren.
Abstract
Doofheid is de meest voorkomende zintuiglijke beperking en treft ongeveer 5% of 430 miljoen mensen wereldwijd volgens de Wereldgezondheidsorganisatie1. Veroudering of presbycusis is een primaire oorzaak van perceptief gehoorverlies en wordt gekenmerkt door schade aan haarcellen, spiraalvormige ganglionneuronen (SGN's) en de stria vascularis. Deze structuren bevinden zich in het slakkenhuis, dat een complexe, spiraalvormige anatomie heeft van vliezige weefsels die in vloeistof zijn gesuspendeerd en omgeven door bot. Deze eigenschappen maken het technisch moeilijk om histopathologische veranderingen te onderzoeken en te kwantificeren. Om aan deze behoefte te voldoen, ontwikkelden we een lichtplaatmicroscoop (TSLIM) die het hele slakkenhuis in beeld kan brengen en digitaliseren om de studie van structuur-functierelaties in het binnenoor te vergemakkelijken. Goed uitgelijnde seriële secties van het hele slakkenhuis resulteren in een stapel afbeeldingen voor driedimensionale (3D) volumeweergave en segmentatie van individuele structuren voor 3D-visualisatie en kwantitatieve analyse (d.w.z. lengte, breedte, oppervlak, volume en aantal). Cochleae vereisen minimale verwerkingsstappen (fixatie, ontkalking, uitdroging, kleuring en optische clearing), die allemaal compatibel zijn met daaropvolgende beeldvorming met hoge resolutie door scanning en transmissie-elektronenmicroscopie. Omdat alle weefsels in de stapels aanwezig zijn, kan elke structuur afzonderlijk of ten opzichte van andere structuren worden beoordeeld. Omdat beeldvorming fluorescerende sondes gebruikt, kunnen immunohistochemie en ligandbinding bovendien worden gebruikt om specifieke structuren en hun 3D-volume of -verdeling binnen het slakkenhuis te identificeren. Hier gebruikten we TSLIM om slakkenhuizen van oude muizen te onderzoeken om het verlies van haarcellen en spiraalvormige ganglionneuronen te kwantificeren. Daarnaast werden geavanceerde analyses (bijv. clusteranalyse) gebruikt om lokale reducties van spiraalvormige ganglionneuronen in het kanaal van Rosenthal langs het 3D-volume te visualiseren. Deze benaderingen tonen het vermogen van TSLIM microscopie aan om structuur-functierelaties binnen en tussen slakkenhuizen te kwantificeren.
Introduction
Het slakkenhuis is het perifere sensorische orgaan voor het gehoor bij zoogdieren. Het heeft een complexe spiraalvormige anatomie van herhalende sensorische en ondersteunende cellen die anatomisch gespecialiseerd zijn om geluidstrillingen te detecteren en deze naar de hersenen door te geven voor de perceptie van het gehoor. De belangrijkste sensorische elementen zijn de binnenste en buitenste haarcellen en hun innervervende zenuwvezels waarvan de cellichamen het spiraalvormige ganglion vormen, dat zich in het kanaal van Rosenthal bevindt (figuur 1). Deze sensorische en neurale structuren zijn tonotopisch zo gerangschikt dat hoogfrequente geluiden worden getransduceerd in de cochleaire basis en laagfrequente geluiden worden getransduceerd in de cochlea apex2. Een anatomische kaart van deze sensorische celverdeling langs de spiraallengte van het ondersteunende basilaire membraan wordt een cytocochleogram3 genoemd en kan worden vergeleken met gehoorverlies als functie van de frequentie zoals afgebeeld in een audiogram.
Het vliezige labyrint van het slakkenhuis, dat is omgeven door dicht bot, maakt het technisch moeilijk om meer dan één cochleaire structuur tegelijk te onderzoeken. Daarom is de reden voor het ontwikkelen van een lichtplaatmicroscoop om goed uitgelijnde seriële secties van het volledige slakkenhuis te produceren, zodat alle cochleaire structuren ten opzichte van elkaar kunnen worden onderzocht in 3D-reconstructies. Voie et al.4 en Voie en Spelman5 ontwierpen de eerste lichtplaatmicroscoop, genaamd orthogonal plane fluorescence optical sectioning (OPFOS) microscoop, om het hele slakkenhuis optisch te snijden. Deze microscoop is echter nooit commercieel ontwikkeld; Ons doel was dus om een lichtplaatmicroscoop te construeren die een thin sheet laser imaging microscope (TSLIM; Figuur 2). De ontwerp- en constructiedetails voor TSLIM zijn eerder gepubliceerd8. TSLIM heeft verschillende verbeteringen aangebracht ten opzichte van de OPFOS, waaronder het gebruik van een digitale camera bij weinig licht versus een CCD-camera voor het verzamelen van afbeeldingen, optisch gecodeerde micropositioners voor nauwkeurige en reproduceerbare beweging van het monster door de lichtplaat, het gebruik van een in de handel verkrijgbare, optisch heldere monsterkamer en Rhodamine-kleuring in ethanol in plaats van in de opruimoplossing om vlekneerslag in het weefsel te voorkomen. Commerciële ontwikkeling van lichtplaatmicroscopen zoals SPIM6 hebben zich gericht op hoge-resolutie beeldvorming van levende, kleine transparante monsters, maar zijn niet geschikt voor hele cochleaire beeldvorming omdat ze onvoldoende werkafstand hebben. Een overzicht van de ontwikkeling van andere lichtplaatmicroscopen werd gepubliceerd door Santi7. Het belangrijkste voordeel van TSLIM ten opzichte van andere histologische methoden om het slakkenhuis te onderzoeken, is het optisch doorsneden van weefsels voor 3D-reconstructie met behoud van de integriteit van het monster, zodat het kan worden gebruikt door andere histologische methoden. Een ander voordeel van TSLIM-beeldvorming is dat alleen een dunne lichtplaat geproduceerd door een laser wordt blootgesteld aan het weefsel, vergeleken met blootstelling van hele weefseldikte aan de laser zoals bij confocale microscopie. Weefselverwijdering om lichtverstrooiing te minimaliseren en het feit dat slechts een klein deel van het weefsel aan de laser wordt blootgesteld, resulteert in minimale fluorochroomvervaging (fotobleaching) met light-sheet laserbeeldvorming. Het proces van fixatie, uitdroging en clearing verandert echter de morfologie van cochleaire structuren en resulteert in weefselkrimp in vergelijking met levend weefsel. De werkelijke hoeveelheid weefselkrimp die optreedt, is niet bepaald.
TSLIM is ontwikkeld door Shane Johnson en acht Duitse studenten optische techniek (zie Dankbetuigingen). TSLIM constructiedetails werden verstrekt door Santi et al.8 en een scanversie (sTSLIM) door Schröter et al.9. TSLIM functioneert als een niet-destructief microtoom om specimens optisch te snijden en als een microscoop om 2D-seriële secties te verzamelen over de volledige breedte en dikte van het slakkenhuis. TSLIM kan zowel kleine (mm) als grote (cm), dikke exemplaren in beeld brengen. Lenzen zijn in de lucht gemonteerd om lange werkafstanden mogelijk te maken met verzamelobjectieven van 1x en 2x op een dissectiemicroscoop. De dissectiemicroscoop heeft ook zoomoptiek waarmee TSLIM subcellulaire en synaptische structuren op cellen kan oplossen. TSLIM is uitgerust met zowel een blauwe (473 nm) als groene (532 nm) laser voor verlichting waarmee een verscheidenheid aan fluorescerende sondes kan worden gebruikt voor beeldvorming. Het doel van TSLIM is om goed uitgelijnde 2D optische secties te produceren door een heel slakkenhuis voor een volledige digitale reconstructie van cochleaire weefsels. Omdat het een fluorescerende methode is, kunnen liganden en immunohistochemie ook worden gebruikt om specifieke cochleaire structuren te identificeren.
Aanvankelijk werd een cilindrische lens gebruikt om twee tegengestelde Gaussische lichtplaten te produceren, maar het produceerde absorptiebeeldartefacten. Door het werk van Keller et al.10 werd de vaste cilindrische lens vervangen door een scanning galvanometer spiegel om het lichtblad9 te produceren. Aangezien het midden van het lichtblad het dunst is bij de taille van de bundel, worden sTSLIM 2D-beelden bovendien geproduceerd door een samenstelling van X-as kolommen met gegevens over de breedte van het monster te verzamelen (figuur 3). Deze methode werd voor het eerst beschreven door Buytaert en Dircks11. TSLIM aangepaste software voor het aansturen en verzamelen van beelden is ontwikkeld met behulp van een grafisch programma voor instrumentbesturing. Het lichtblad reist door het monster en verlicht een fluorescerend vlak in het weefsel. Dit fluorescerende vlak wordt orthogonaal door het transparante monster geprojecteerd en wordt verzameld door een dissectiemicroscoop. Optisch gecodeerde micropositioners maken het mogelijk om door de straaltaille in de X-as te scannen om een enkel samengesteld 2D-beeld te verzamelen en vervolgens verplaatst de Z-as micropositioner het monster naar een dieper vlak in het weefsel om een stapel seriële, doorsnedede 2D-beelden te verkrijgen (Video 1, Figuur 4). Een stapel translationele afbeeldingen wordt verzameld over de gehele breedte, dikte en lengte van het slakkenhuis en het naaien van afbeeldingen is niet vereist (video 2). De afbeeldingsstapel wordt overgebracht naar een andere computer en geladen in een 3D-renderingprogramma voor 3D-reconstructie en kwantificering. De beeldstapels bevatten alle digitale informatie over de morfologie van een slakkenhuis bij de resolutie van de microscoop. Als echter een hogere resolutie vereist is, kan het intacte slakkenhuis verder worden verwerkt door destructieve histologische methoden zoals microtoomsectie, scannen en transmissie-elektronenmicroscopie.
Het 3D-renderingprogramma wordt gebruikt om verschillende cochleaire structuren te segmenteren voor 3D-rendering en kwantitatieve analyse. Voor segmentatie wordt elke structuur in elke 2D-afbeelding van de stapel met een andere kleur overgetrokken door een grafisch tablet en pen (afbeelding 5). Tot op heden zijn 20 verschillende cochleaire structuren gesegmenteerd (figuur 6). Na segmentatie kunnen verschillende 3D-analyses worden uitgevoerd. 3D-renderingsoftware kan bijvoorbeeld het slakkenhuis virtueel resectieren in elk vlak langs het centrum van de structuur. Video 3 toont secties die raken aan het orgaan van Corti, waardoor de haarcellen over de lengte van het basilaire membraan worden onthuld. Dit proces vereist eerst handmatige segmentatie van de structuur van belang. Vervolgens wordt de centroïde van de structuur berekend op basis van de kleinste vierkanten die passen bij splinepunten die langs het midden van de structuur van de basis tot de top zijn geplaatst, waardoor een benadering van de lengte van de structuur mogelijk is (Video 4). Een soortgelijk proces genaamd skeletonisatie kan worden gebruikt om de radiale breedte van de structuur over de lengte te visualiseren met behulp van een kleurenkaart (Video 4). Het totale volume van elke structuur wordt na segmentatie door het programma berekend, maar relatieve afstanden kunnen ook worden gekwantificeerd en gevisualiseerd met kleurenkaarten in een 3D-renderingsoftware (figuur 7). Gesegmenteerde structuren kunnen ook worden geëxporteerd om vergrote, massief-plastic modelweergaven te produceren (figuur 8). Daarnaast kan semi-geautomatiseerde celtelling ook worden uitgevoerd met behulp van 3D-renderingsoftware (figuur 9). Immunohistochemie en ligandbinding kunnen worden gebruikt om specifieke cochleaire structuren te kleuren en deze structuren kunnen worden geïsoleerd van andere cochleaire structuren voor morfometrische beoordeling, zoals het produceren van een cytocochleogram (figuur 10). Lengte, breedte, oppervlak, volume en aantal van alle cochleaire structuren kunnen worden bepaald uit de 3D-modellen, waardoor deze aanpak ideaal is voor het in kaart brengen van cochleaire schade aan functionele beperkingen. In het bijzonder kan cochleaire schade als gevolg van veroudering, door lawaai veroorzaakt trauma of andere beledigingen worden getoond en gekwantificeerd in 3D-cochleaire reconstructies van 2D-optische secties. Zodra een slakkenhuis is gedigitaliseerd, zijn er tal van beeldvormingsalgoritmen die kunnen worden gebruikt om cochleaire schade van elk weefsel in het slakkenhuis in het anatomische register aan andere cochleaire weefsels te beoordelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures en het gebruik van levende dieren zijn beoordeeld en goedgekeurd (Protocol ID # 2010-38573A) door de University of Minnesota Institutional Care and Use Committee (IACUC) en onderzoekers die deze dieren gebruiken, zijn grondig getraind en getest door de Research Animal Resources (RAR) Dierenartsen voordat ze toegang hebben tot de dierfaciliteiten. Zowel mannelijke als vrouwelijke muizen werden gebruikt in deze studie.
1. Cochlea-verwijdering voor fixatie en weefselverwerking voor beeldvorming
- Euthanaseer een muis met behulp van CO 2-inhalatie. Onthoofd de muis met een schaar en maak een dorsaal-ventrale incisie door de hersenen om de schedel te hemisecten. Verwijder de hersenen, identificeer de ronde bulla in het baso-ventrale deel van de schedel, open de bulla met rongeurs en visualiseer en verwijder het slakkenhuis.
- Fixatie: Voer deze procedure uit onder een zuurkast en met behulp van een dissectiemicroscoop bij 5x vergroting. Draag handschoenen en beschermende kleding. Doorprik het ovale venster en verwijder de nietjes met een scherpe pik. Steek een plectrum in het ronde venster om het membraan te doorboren.
- Bedek het geopende ronde venster met de gesneden punt van een infusieset die is bevestigd aan een spuit van 1 ml gevuld met 2 ml formaline. Infundeer formaline langzaam door de perilymfatische ruimtes van het slakkenhuis gedurende een periode van 2 minuten, waarbij wordt opgemerkt dat formaline het slakkenhuis verlaat via het geopende ovale venster. Snijd overtollig weefsel van het slakkenhuis en dompel het onder in een fles met 10% formaline en plaats het een nacht op een rotator.
- Ontkalking: Spoel het slakkenhuis in PBS 3x gedurende 5 minuten elk en dompel onder in een fles met 10% oplossing van dinatriumethyleendiaminetetra-azijnzuur (EDTA) met rotatie gedurende 4 dagen, waarbij de oplossing dagelijks wordt vervangen.
- Uitdroging: Perfuseer het slakkenhuis met PBS 3x en dompel 15 minuten onder tussen de veranderingen. Droog het slakkenhuis uit met oplopende concentraties ethanol 10%, 50%, 70%, 95%, 95%, 100%, 100%; gedurende 30 minuten in elke concentratie.
OPMERKING: Het is belangrijk om alle EDTA te verwijderen voordat het uitdroogt, omdat EDTA neerslaat in ethanol. Ook kan slakkenhuis 's nachts in elke concentratie ethanol van meer dan 70% worden achtergelaten. - Kleuring: Bevlek het hele slakkenhuis door onderdompeling in een oplossing van Rhodamine B-isothiocynaat (5 μg / ml in 100% ethanol) 's nachts met rotatie. Verwijder overtollige kleurstof uit het slakkenhuis met twee veranderingen van 100% ethanol, 5 min elke verandering.
- Clearing: Breng het gekleurde slakkenhuis over in twee veranderingen van Spalteholz12-oplossing (5:3 methylsalicylaat:benzylbenzoaat), 30 minuten per verandering en laat een nacht in de clearingoplossing met rotatie. Cochleae kan voor onbepaalde tijd in Spalteholz-oplossing worden achtergelaten.
2. Beeldvorming van slakkenhuis
- Bevestig het slakkenhuis aan een monsterstaaf aan het ovale en ronde venstermembraanuiteinde, zodat de opruimoplossing in het slakkenhuis blijft en er geen bellen worden gevormd (figuur 2). Er moet voor worden gezorgd dat er geen bubbels in het slakkenhuis ontstaan, omdat ze moeilijk te verwijderen zijn en als ze in het weefsel worden achtergelaten, zullen ze beeldvormingsartefacten veroorzaken.
- Gebruik een UV-activerende lijm om het natte slakkenhuis aan de droge monsterstaaf te bevestigen (figuur 2). Bevestig het slakkenhuis aan de ovale en ronde vensteruiteinden. Harde de UV-lijm 10 s uit door met het UV-licht rond het slakkenhuis te bewegen.
OPMERKING: Een losse bevestiging van het slakkenhuis aan de monsterstaaf zal resulteren in beeldvormingsdefecten. Deze staaf is speciaal vervaardigd voor dit protocol (zie Santi et al.8 voor details) en is specifiek voor onze light-sheet microscoop. - Suspensie van het slakkenhuis in de beeldvormingskamer gevuld met Spalteholz oplossing voor beeldvorming. De monsterkamer is een optisch heldere kwartsfluorometercel (Video 1).
- Bevestig de monsterstang aan een roterende houder die ook aan de XZ-vertaaltrap is bevestigd. De meeste stapels worden verkregen door het specimen in de XZ-vlakken te vertalen, maar er kunnen ook rotatiestapels worden verkregen.
- TSLIM optische sectie: Gebruik een blauwe of groene laser voor excitatie, afhankelijk van het type fluorochroomkleuring. Plaats het lichtvel in het midden van het weefsel om scherp te stellen en bepaal de vergroting die zal worden gebruikt om de volledige breedte van het slakkenhuis te verlichten. Gebruik vervolgens een op maat ontworpen programma om het monster door het lichtvel over het monster te bewegen in de X-as (het beeld naaien) en in Z-stappen om een stapel 2D-afbeeldingen door het slakkenhuis te maken.
- Voor de eerste afbeelding wordt de balktaille van het lichtblad aan de rand van het monster geplaatst en scant het programma de volledige breedte van het monster en verzamelt het kolommen met gegevens (zie afbeeldingsstiksels; Santi et al.8) die de breedte van de confocale parameter (figuur 3) zijn om een samengesteld 2D-beeld met maximale resolutie over de breedte van het monster te produceren. Het programma automatiseert het naaien van afbeeldingen voor elke Z-stap totdat het monster volledig in beeld is gebracht.
- Beeldverwerking: breng de afbeeldingsstapel over naar een andere computer en laad deze in een 3D-renderingprogramma voor 3D-reconstructie en kwantificering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Omdat het thema van dit speciale nummer het in beeld brengen van de effecten van veroudering in het slakkenhuis is, zal een jong (3 maanden oud, HS2479, CBA-stammuis) en oud (23 maanden oud, HS2521, C57-stammuis) slakkenhuis als voorbeeld worden gebruikt. Opgemerkt moet worden dat TSLIM in staat is om een verscheidenheid aan exemplaren af te beelden, waaronder slakkenhuizen van mensen, zoogdieren, andere knaagdieren en vissen, evenals andere organen zoals de hersenen.
Johnson et al. 13 publiceerden een artikel over SGN's bij jonge (3 weken oude) CBA-muizen met behulp van TSLIM. Alle SGN's werden geteld in vijf muizen en er was een bereik van 8.408-8.912 SGN's met een gemiddelde Rosenthal-lengte van 2,0 mm. In de huidige studie telden we de SGN's in een 3 maanden oude CBA-muis die 7.913 SGN's bevatte in een Rosenthal-kanaallengte van 2,0 mm. De 23 maanden oude C57BL6-muis bevatte 6.521 SGN met een Rosenthal-lengte van 2,11 mm. Een volumeweergave toont alle SGN's in beide slakken, maar SGN-verlies werd niet onthuld in de oudere muis. SGN-celtellingen als functie van de kanaalafstand van Rosenthal, weergegeven in een lineaire plot, toonden echter grotere SGN's bij het jongere dier in het midden en apicale uiteinden van het slakkenhuis in vergelijking met het oudere dier (figuur 11). Dit schijnbare verlies van SGN's werd verder gevisualiseerd door gebruik te maken van clusteranalyse in 3D-renderingsoftware. Hier werden SGN-dichtheidsverschillen weergegeven op een kleurenschaal waarbij clusters met hoge dichtheid geel zijn en blauw regio's met een lagere dichtheid vertegenwoordigt (figuur 12). Hoewel het niet mogelijk is om specifieke cellen te identificeren die verloren zijn gegaan, visualiseert de clusteranalyse duidelijk gebieden met een lagere celdichtheid langs de lengte van het kanaal van Rosenthal (figuur 12).
Figuur 1: Directe volumeweergave van een slakkenhuis. Een samengestelde figuur uit een volumeweergave van een muizenslakkenhuis met de ovale (O) en ronde (R) vensters, orgaan van Corti met haarcellen (blauwe lijn, OC) en Rosenthal's kanaal dat is gesegmenteerd en volume weergegeven dat spiraalvormige ganglionneuronen (SGN's) bevat. Bar = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Monsterhouder. Een houten prototype van een aangepaste monsterhouder voor bevestiging van het slakkenhuis (pijlpunt) aan een specimenstaaf (pijl) met behulp van UV-geactiveerde lijm terwijl de opruimoplossing in het slakkenhuis blijft. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Lichte plaatdoorsnede. Een doorsnede door een X-as gescande lichtplaat met de bundeltaille in het midden van de lichtplaat en de confocale parameter (CP), een gebied waar de bundeldikte relatief constant is. De bovenste vaste weergave toont de breedte van de balk zonder te scannen en de onderste vaste weergave toont de breedte van de gescande balk die dun blijft over de volledige breedte van het slakkenhuis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Een mid-modiolar 2D-doorsnede door een muizenslakkenhuis. Vier cochleaire bochten zijn gesegmenteerd. De basale draai van Rosenthal's kanaal is te zien met bolvormige spiraalvormige ganglionneuronen. Bar = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Twee doorsneden van het slakkenhuis. Aan de linkerkant is een 2D-doorsnede en aan de rechterkant is hetzelfde gedeelte met verschillende structuren die zijn gesegmenteerd met behulp van verschillende gekleurde overtrek. Bar = 200 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Cochleaire structuren gesegmenteerd. (A) Deze figuur toont een gesegmenteerd slakkenhuis met de omringende otische capsule. (B-K) Deze tonen verschillende cochleaire structuren die zijn gesegmenteerd en de centroïden (witte lijn) worden voor de meeste structuren bepaald. Cochleaire structuren zijn gesegmenteerd met verschillende kleuren voor hun identificatie: (A) samengestelde figuur met bot (wit), (B) turkoois (spiraalligament), (C) kastanjebruin (stria vascularis), (D) geel (basilair membraan), (E) rood (orgaan van Corti), (F) geelgroen (Rosenthal's kanaal), (G) blauw (scala tympani), goud (stapes voetplaat), (H) wit (scala media), groen (ductus reuniens), (I) rood (scala vestibuli), paars (rond venstermembraan), goud (cochleair aquaduct), (J) groen (tectoriale membraan), (K) paars (spiraalvormige limbus). Bar = 400 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Vergelijking van dezelfde cochleaire structuur in twee verschillende slakkenhuizen. Met behulp van de Procrustus-methode in 3D-renderingsoftware zijn de Scala-media van twee verschillende muizen vergeleken. Het linkerdeelvenster toont de aanpassing van een kleinste-kwadraten-pasvorm van twee structuren en het rechterpaneel toont hun kwantitatieve verschillen met behulp van een kleurenkaart. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Massief 3D kunststof model van het slakkenhuis. Het linkerpaneel toont de Scala tympani van een muizenslakkenhuis met het basilaire membraan, orgaan van Corti en helicotrema gesegmenteerd. Het rechterpaneel toont een massief plastic model van de structuren aan de linkerkant. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 9: Spiraal ganglion neuron tellen. SGN's zijn geïdentificeerd en gemarkeerd door het 3D-renderingsoftwareprogramma op een doorsnede van de Scala-media van het slakkenhuis van de muis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 10: Immunohistochemische labeling van buitenste haarcellen. Anti-prestin-antilichamen en fluorescerende secundaire antilichamen die door de perilymfatische Scala van een muizenslakkenhuis werden geperfuseerd, hebben alle buitenste haarcellen gelabeld die zijn geretourneerd met behulp van 3D-renderingsoftware. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 11: Dichtheid van SGN's over de lengte van Rosenthal's kanaal. Het grootste verlies aan SGN's lijkt zich te bevinden in de middelste en apicale uiteinden van Rosenthals kanaal in de 23 maanden oude muis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 12: Clusteranalyse van SGN-celdichtheid. Het linkerpaneel toont een clusteranalyse van SGN's in een 3 maanden oude, normaal horende muis. Een kleurenkaart laat zien dat de grootste dichtheid van cellen binnen een cluster van een bepaalde grootte zich in het middelste Rosenthal-kanaal bevindt, waar de gehoordrempels van muizen het laagst zijn. Het rechterpaneel toont het verlies van SGN's in het kanaal van Rosenthal met het grootste verlies van SGN's in het midden van het kanaal van Rosenthal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Video 1: X-as scannen video van het slakkenhuis. X-as scannen van het monster door de lichtplaat met het slakkenhuis dat door de monsterstaaf in de opruimingsoplossing in een glazen kamer hangt. Een orthogonale 2D fluorescerende doorsnede van het slakkenhuis wordt getoond als gevolg van verlichting door de lichtplaat. Klik hier om deze video te downloaden.
Video 2: Stapel seriële secties van het slakkenhuis. Een korte stapel 2D-doorsneden wordt verkregen door X-as scannen en 10 μm Z-stappen door het slakkenhuis. Let op de aanwezigheid van horizontale lijnen door de stapel, die absorptieartefacten zijn als gevolg van het gebruik van een cilindrische lens om de lichtplaat te produceren. Klik hier om deze video te downloaden.
Video 3: Resectie van een slakkenhuis in een ander vlak. Een stapel geladen in het 3D-rendering softwareprogramma en virtuele resectie in een vlak dat raakt aan het orgaan van Corti en de haarcellen langs de lengte van het basilaire membraan toont. Deze video is aangepast van8. Klik hier om deze video te downloaden.
Video 4: Skeletvorming van de Scala media. Het linkerpaneel toont de berekening van de centroïde binnen de Scala-media van een muizenslakkenhuis. Het rechterdeelvenster toont een kleurenkaart van de radiale afmetingen van het Scala-medium over de lengte. Klik hier om deze video te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Optische doorsnede door lichtplaatmicroscopie voor onderzoek van cochleaire structuren is niet mechanisch destructief zoals andere meer traditionele histologische methoden, en het biedt een volledig digitaal beeld van cochleaire structuren ten opzichte van elkaar. Eerdere methoden zoals oppervlaktepreparaten van het orgaan van Corti14 leverden een kaart op van haarcelverlies langs de lengte van het basilaire membraan, maar SGN-verlies kon niet worden beoordeeld omdat het weefsel was ontleed om het orgaan van Corti te onthullen. Als alternatief bieden mid-modoilar microtoomsecties van het slakkenhuis slechts een zeer klein monster van de toestand van de SGN's over de hele lengte van het kanaal van Rosenthal. Met TSLIM worden alle cochleaire structuren gedigitaliseerd op het niveau van de resolutie van het instrument (d.w.z. subcellulair). Complete beeldstapels van het slakkenhuis maken kwantificering en visualisatie van meerdere cochleaire structuren mogelijk, die hier worden getoond, die niet konden worden verkregen met traditionele histologische methoden. Met behulp van een clusteringalgoritme toonde het huidige onderzoek bijvoorbeeld een volledig nieuwe manier om de SGN-celdichtheid in het kanaal van Rosenthal te bekijken en te kwantificeren en celverlies als gevolg van veroudering te karakteriseren (figuur 12).
TSLIM is een vroege8 ontwikkeling van een lichtplaatmicroscoop die geïnspireerd is op het werk van Voie en collega's 4,5. Specificaties voor de bouw van TSLIM zijn opgenomen in het artikel van Santi et al.8. Brown et al.15 verklaarden zelfs dat ze een vergelijkbare lichtplaatmicroscoop bouwden voor het in beeld brengen van het slakkenhuis op basis van het ontwerp van TSLIM. Zoals vermeld in de inleiding en beoordeeld door Santi7, was de ontwikkeling van andere lichtplaatmicroscopen (bijv. SPIM) gericht op het onderzoeken van de ontwikkeling van levende cellen en kreeg een betere resolutie door onderdompeling van hoge N.A.-objectieven in de monsterkamer, die kleine werkafstanden vereiste en ongeschikt is voor het afbeelden van hele slakkenhuizen. De commerciële ontwikkeling van lichtplaatmicroscopen gaat door en dit type beeldvorming is uiterst nuttig voor het bereiden van goed uitgelijnde, seriële secties van weefsels en dieren die transparant zijn gemaakt door chemische opruimmethoden.
Voor elke toepassing van lichtplaatmicroscoop is het van cruciaal belang dat het monster transparant wordt gemaakt om lichtverstrooiing en -absorptie te voorkomen. Ontkalking is de eerste stap in het proces om calcium uit het slakkenhuis te verwijderen voor transparantie. Als EDTA niet volledig uit het weefsel wordt gespoeld voordat het wordt uitgedroogd, zal het in het weefsel neerslaan en is een goede beeldvorming niet mogelijk. Dehydratie door ethanol is noodzakelijk voor infiltratie van de Spalteholz-reinigingsoplossing. Als een monster zwaar gepigmenteerd is, kan het bleken van het pigment helpen om het monster transparanter te maken. Er zijn veel andere chemicaliën en methoden die kunnen worden gebruikt om een monster transparant te maken en gebruikers willen misschien verschillende methoden proberen om te bepalen welke methode het meest geschikt is voor hun monster. Hoewel light-sheet microscopie 2D-beelden van weefsel produceert, is de resolutie niet zo groot als kan worden verkregen uit dunne mechanische secties van weefsel (vooral plastic secties) en brightfield-microscopie. Het belangrijkste voordeel is om goed uitgelijnde, seriële weefselsecties te produceren voor 3D-reconstructie van structuren.
De twee muizen cochleae die we laten zien als voorbeelden van SGN-verlies als gevolg van veroudering onthullen verlies van neuronen als gevolg van veroudering. Een onverwachte bevinding was het verlies van SGN's in het midden en apicale uiteinden van het slakkenhuis in plaats van een basaal verlies dat zou overeenkomen met een verlies van haarcellen in de basis. We hebben echter geen haarcelverlies in deze slakkenhuizen beoordeeld en de twee monsters zijn slechts voorbeelden in plaats van een onderzoek naar de verouderingseffecten op SGN's. In een artikel van White et al.16 beschreven ze SGN-verlies bij 18 maanden oude C57-muizen, maar bepaalden ze niet de verdeling van het verlies langs de lengte van het kanaal van Rosenthal. In een ander artikel van Grierson et al.17, met behulp van 24-28 maanden oude muizen, beschreven ze massale degeneratie van OHC-efferenten, vooral in de apicale helft van het slakkenhuis, waar er ook een aanzienlijk verlies van OHC's was. Inderdaad, de toekomst biedt veel mogelijkheden voor het extraheren van nieuwe gegevens en het verkrijgen van een beter begrip van pathologische processen in het slakkenhuis als gevolg van veroudering en andere beledigingen. Bovendien zijn cochleaire beeldstapels aan veel andere onderzoekers verstrekt en het zal interessant zijn om te zien hoe deze onderzoekers gegevens ontginnen om hun onderzoeksvragen te beantwoorden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit onderzoek is ondersteund door subsidies van het National Institute on Deafness and Other Communication Disorders van de National Institutes of Health, de Kellogg Foundation en particuliere donaties van Bridget Sperl en John McCormick. TSLIM is ontwikkeld met de uitstekende hulp van Matthias Hillenbrand, Kerstin John, Meike Lawin, Michel Layher, Tobias Schroeter, Peter Schacht, Oliver Dannberg en Julian Wuester van de Technische Universiteit van Illmenau, Duitsland, onder supervisie van hun mentoren (Stefan Sinzinger en Rene Theska) en James Leger.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Amira 3D Rendering Software | ThermoFisher Scientific | Address: 501 90th Ave NW, Coon Rapids, MN 55433 | |
| benzyl benzoate (W213810) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Bondic | Bondic | Address: 235 Industrial Parkway S., Unit 18 Aurora, ON L4G 3V5 Canada | |
| Ethanol 95% and 100% | University of Minnesota | Address: General Storehouse, Minneapolis, MN 55455 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) (E5134) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| LabVIEW graphical program and Vision | National Instruments | Address: 11500 N Mopac Expwy Austin, TX 78759-3504 | |
| methyl salicylate (M6742) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Olympus MVX10 dissection microscope | Olympus Corp | Address: 3500 Corporate Parkway, Center Valley, PA 18034 | |
| Rhodamine B isothiocynate, (283924) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Starna Flurometer Cell (3-G-20) | Starna Cells | Address: PO Box 1919, Atascadero, CA 82423 |
References
- Deafness and hearing loss. World Health Organization. , Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/deafness-and-hearing-loss (2021).
- Vater, M., Kössl, M. Comparative aspects of cochlear functional organization in mammals. Hearing Research. 273 (1-2), 89-99 (2011).
- Santi, P. A., Blair, A., Bohne, B. A., Lukkes, J., Nietfeld, J.
- Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. Journal of Microscopy. 170, 229-236 (1993).
- Voie, A. H., Spelman, S. A. Three-dimensional reconstruction of the cochlea from two-dimensional images of optical sections. Computerized Medical Imaging and Graphics. 19 (5), 377-384 (1995).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (2), 129-138 (2011).
- Santi, P. A., et al. Thin-sheet laser imaging microscopy for optical sectioning of thick tissues. BioTechniques. 46 (4), 287-294 (2009).
- Schröter, T. J., Johnson, S. B., John, K., Santi, P. A. Scanning thin-sheet laser imaging microscopy (sTSLIM) with structured illumination and HiLo background rejection. Biomedical Optics Express. 3 (1), 170-177 (2012).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
- Buytaert, J. A. N., Dirckx, J. J. J. Design and quantitative resolution measurements of an optical virtual sectioning three-dimensional imaging technique for biomedical specimens, featuring two-micrometer slicing resolution. Journal of Biomedical Optics. 12 (1), 014039 (2007).
- Spalteholz, W. On making human and animal preparations transparent. , S. Hierzel. Leipzig, Germany. (1914).
- Johnson, S., Schmitz, H., Santi, P. TSLIM imaging and a morphometric analysis of the mouse spiral ganglion. Hearing Research. 278 (1-2), 34-42 (2011).
- Santi, P. A. Organ of Corti surface preparations for computer-assisted morphometry. Hearing Research. 24 (3), 179-187 (1986).
- Brown, D., Pastras, C., Curthoys, I., Southwell, C., Van Roon, L. Endolymph movement visualized with light sheet fluorescence microscopy in an acute hydrops model. Hearing Research. 339, 112-124 (2016).
- White, J. A., Burgess, B. J., Hall, R. D., Nadol, J. B. Pattern of degeneration of the spiral ganglion cell and its processes in the C57BL/6J mouse. Hearing Research. 141 (1-2), 12-18 (2000).
- Grierson, K. E., Hickman, T. T., Liberman, M. C. Dopaminergic and cholinergic innervation in the mouse cochlea after noise-induced or age-related synaptopathy. Hearing Research. 422, 108533 (2022).
