광시트 형광 현미경을 이용한 노화된 달팽이관 이미징
Summary
전체 달팽이관을 이미지화하고 디지털화하기 위해 광시트 현미경이 개발되었습니다.
Abstract
난청은 가장 흔한 감각 장애로, 세계보건기구(WHO)에 따르면 전 세계적으로 약 5%인 4억 3천만 명에게 영향을 미칩니다1. 노화 또는 노안은 감각신경성 난청의 주요 원인이며 유모 세포, 나선형 신경절 뉴런(SGN) 및 선조체 혈관의 손상을 특징으로 합니다. 이러한 구조는 달팽이관 내에 있으며, 달팽이관은 액체에 매달려 있고 뼈로 둘러싸인 막 조직의 복잡한 나선형 해부학적 구조를 가지고 있습니다. 이러한 특성으로 인해 조직병리학적 변화를 조사하고 정량화하는 것이 기술적으로 어렵습니다. 이러한 요구를 해결하기 위해 우리는 내이의 구조-기능 관계에 대한 연구를 용이하게 하기 위해 전체 달팽이관을 이미지화하고 디지털화할 수 있는 광시트 현미경(TSLIM)을 개발했습니다. 전체 달팽이관의 잘 정렬된 연속 절편은 3차원(3D) 볼륨 렌더링을 위한 이미지 스택과 3D 시각화 및 정량 분석(즉, 길이, 너비, 표면, 부피 및 수)을 위한 개별 구조의 분할을 생성합니다. 달팽이관은 최소한의 처리 단계(고정, 석회질 제거, 탈수, 염색 및 광학 투명화)가 필요하며, 이 모든 단계는 주사 및 투과 전자 현미경에 의한 후속 고해상도 이미징과 호환됩니다. 모든 조직이 스택에 존재하기 때문에 각 구조는 개별적으로 또는 다른 구조와 비교하여 평가할 수 있습니다. 또한 이미징은 형광 프로브를 사용하기 때문에 면역조직화학 및 리간드 결합을 사용하여 달팽이관 내의 특정 구조와 3D 부피 또는 분포를 식별할 수 있습니다. 여기에서 우리는 TSLIM을 사용하여 노화된 쥐의 달팽이관을 검사하여 유모 세포와 나선형 신경절 뉴런의 손실을 정량화했습니다. 또한 고급 분석(예: 클러스터 분석)을 사용하여 3D 부피를 따라 Rosenthal 운하에서 나선형 신경절 뉴런의 국소 감소를 시각화했습니다. 이러한 접근법은 달팽이관 내부 및 달팽이관 사이의 구조-기능 관계를 정량화하는 TSLIM 현미경의 능력을 보여줍니다.
Introduction
달팽이관은 포유류의 청각을 위한 말초 감각 기관입니다. 그것은 소리 진동을 감지하고 청각을 위해 뇌로 전달하도록 해부학적으로 특화된 감각 및 지지 세포를 반복하는 복잡한 나선형 해부학을 가지고 있습니다. 주요 감각 요소는 내부 및 외부 유모 세포와 세포체가 Rosenthal의 운하 내에 있는 나선형 신경절을 구성하는 신경 분포 신경 섬유입니다(그림 1). 이러한 감각 및 신경 구조는 고주파 소리가 달팽이관 기저부에서 전달되고 저주파 소리가 달팽이관 정점에서 전달되도록 강압적으로 배열되어 있습니다2. 지지 기저막의 나선형 길이를 따라 분포된 감각 세포 분포의 해부학적 지도를 세포달팽이관(cytocochleogram)3 이라고 하며, 청력도에 묘사된 바와 같이 주파수의 함수로서 청력 손실과 비교할 수 있습니다.
빽빽한 뼈로 둘러싸인 달팽이관의 막 미로는 한 번에 둘 이상의 달팽이관 구조를 검사하는 것을 기술적으로 어렵게 만듭니다. 따라서 광시트 현미경을 개발하는 이유는 3D 재구성에서 모든 달팽이관 구조를 서로에 대해 검사할 수 있도록 전체 달팽이관의 잘 정렬된 직렬 섹션을 생성하는 것입니다. Voie et al.4 와 Voie 및 Spelman5 는 전체 달팽이관을 광학적으로 절편하기 위해 OPFOS(직교면 형광 광학 절편) 현미경이라고 하는 최초의 광판 현미경을 설계했습니다. 그러나 이 현미경은 상업적으로 개발된 적이 없습니다. 그래서 우리의 목표는 얇은 시트 레이저 이미징 현미경(TSLIM; 그림 2). TSLIM의 설계 및 시공 세부 사항은 이전에 발표되었습니다8. TSLIM은 이미지 수집을 위해 저조도 디지털 카메라와 CCD 카메라를 사용하는 것, 라이트 시트를 통한 표본의 정확하고 재현 가능한 이동을 위해 광학적으로 인코딩된 마이크로포지셔너, 상업적으로 이용 가능한 광학적으로 투명한 표본 챔버 사용, 조직 내 얼룩 침전을 방지하기 위해 투명 용액이 아닌 에탄올에서 로다민 염색을 사용하는 등 OPFOS에 비해 몇 가지 개선 사항을 이루었습니다. SPIM6 과 같은 광시트 현미경의 상업적 개발은 살아 있는 작고 투명한 표본의 고해상도 이미징에 중점을 두었지만 적절한 작동 거리가 부족하기 때문에 전체 달팽이관 이미징에는 적합하지 않습니다. 다른 광판 현미경의 개발에 대한 리뷰는 Santi7에 의해 발표되었습니다. 달팽이관을 검사하는 다른 조직학적 방법에 비해 TSLIM의 주요 이점은 검체의 무결성을 보존하면서 3D 재구성을 위해 조직을 광학적으로 절단하여 다른 조직학적 방법으로 사용할 수 있다는 것입니다. TSLIM 이미징의 또 다른 장점은 컨포칼 현미경에서와 같이 레이저에 노출된 전체 조직 두께에 비해 레이저에 의해 생성된 얇은 광시트만 조직에 노출된다는 것입니다. 광 산란을 최소화하기 위한 조직 투명화와 조직의 작은 부분만 레이저에 노출된다는 사실은 광시트 레이저 이미징으로 최소한의 형광색 퇴색(광표백)을 초래합니다. 그러나 고정, 탈수 및 제거 과정은 달팽이관 구조의 형태를 변경하고 생체 조직에 비해 조직 수축을 초래합니다. 발생하는 실제 조직 수축량은 결정되지 않았습니다.
TSLIM은 Shane Johnson과 8명의 독일 광공학도에 의해 개발되었습니다( 감사의 말 참조). TSLIM 구조 세부 사항은 Santi et al.8 에 의해 제공되었고 스캐닝 버전(sTSLIM)은 Schröter et al.9에 의해 제공되었습니다. TSLIM은 표본을 광학적으로 절편하는 비파괴 마이크로톰과 달팽이관의 전체 너비와 두께를 통해 2D 직렬 절편을 수집하는 현미경 역할을 합니다. TSLIM은 작은(mm) 및 큰(cm) 두꺼운 표본을 모두 이미지화할 수 있습니다. 렌즈는 해부 현미경에서 1x 및 2x의 수집 목표로 긴 작동 거리를 허용하도록 공기 장착됩니다. 해부 현미경에는 TSLIM이 세포의 세포 내 및 시냅스 구조를 분해할 수 있도록 하는 줌 광학 장치도 있습니다. TSLIM에는 조명용 청색(473nm) 및 녹색(532nm) 레이저가 모두 장착되어 있어 다양한 형광 프로브를 이미징에 사용할 수 있습니다. TSLIM의 목표는 달팽이관 조직의 완전한 디지털 재구성을 위해 전체 달팽이관을 통해 잘 정렬된 2D 광학 섹션을 생성하는 것입니다. 형광 방법이기 때문에 리간드와 면역조직화학을 사용하여 특정 달팽이관 구조를 식별할 수도 있습니다.
처음에는 원통형 렌즈를 사용하여 두 개의 대향 가우스 광 시트를 생성했지만 흡수 이미징 아티팩트를 생성했습니다. Keller et al.10의 작업으로 인해 고정 원통형 렌즈는 스캐닝 검류계 거울로 대체되어 라이트 시트9를 생성했습니다. 또한 라이트 시트의 중심이 빔 허리에서 가장 얇기 때문에 시편 너비에 걸쳐 X축 열의 합성 데이터를 수집하여 sTSLIM 2D 이미지를 생성합니다(그림 3). 이 방법은 Buytaert와 Dircks11에 의해 처음 설명되었습니다. 이미지를 구동하고 수집하는 TSLIM 맞춤형 소프트웨어는 기기 제어를 위한 그래픽 프로그램을 사용하여 개발되었습니다. 라이트 시트는 표본을 통과하여 조직 내의 형광면을 비춥니다. 이 형광면은 투명 표본을 통해 직각으로 투사되고 해부 현미경으로 수집됩니다. 광학적으로 인코딩된 마이크로포지셔너는 X축의 빔 허리를 통해 스캔하여 단일 복합 2D 이미지를 수집한 다음 Z축 마이크로포지셔너가 표본을 조직 내의 더 깊은 평면으로 이동하여 일련의 단면화된 2D 이미지 스택을 얻을 수 있도록 합니다(비디오 1, 그림 4). 달팽이관의 전체 너비, 두께 및 길이를 통해 번역 이미지 스택이 수집되며 이미지 스티칭이 필요하지 않습니다(비디오 2). 이미지 스택은 다른 컴퓨터로 전송되어 3D 재구성 및 정량화를 위해 3D 렌더링 프로그램에 로드됩니다. 이미지 스택에는 현미경 해상도에서 달팽이관의 형태에 대한 모든 디지털 정보가 포함되어 있습니다. 그러나 더 높은 해상도가 필요한 경우 온전한 달팽이관은 마이크로톰 절편, 스캐닝 및 투과 전자 현미경과 같은 파괴적인 조직학적 방법으로 추가 처리할 수 있습니다.
3D 렌더링 프로그램은 3D 렌더링 및 정량 분석을 위해 다양한 달팽이관 구조를 분할하는 데 사용됩니다. 분할을 위해 스택의 모든 2D 이미지에 있는 각 구조는 그래픽 태블릿과 펜으로 다른 색상을 사용하여 추적됩니다(그림 5). 현재까지 20개의 서로 다른 달팽이관 구조가 분할되었습니다(그림 6). 분할 후 다양한 3D 분석을 수행할 수 있습니다. 예를 들어, 3D 렌더링 소프트웨어는 구조물의 중심을 따라 모든 평면에서 달팽이관을 가상으로 절제할 수 있습니다. 비디오 3 은 기저막의 길이를 따라 유모 세포를 드러내는 Corti 기관에 접하는 절편을 보여줍니다. 이 프로세스에는 먼저 관심 있는 구조를 수동으로 분할해야 합니다. 다음으로, 구조의 중심은 밑면에서 정점까지 구조의 중심을 따라 배치된 스플라인 점의 최소 제곱 맞춤을 기반으로 계산되므로 구조의 길이를 근사화할 수 있습니다(비디오 4). 스켈레톤화(skeletonization)라고 하는 유사한 프로세스를 사용하여 색상 맵을 사용하여 길이를 따라 구조의 반경 방향 너비를 시각화할 수 있습니다(비디오 4). 각 구조물의 총 부피는 분할 후 프로그램에 의해 계산되지만, 상대 거리는 3D 렌더링 소프트웨어에서 컬러 맵으로 정량화하고 시각화할 수도 있습니다(그림 7). 분할된 구조를 내보내 확대된 솔리드 플라스틱 모델 렌더링을 생성할 수도 있습니다(그림 8). 또한 3D 렌더링 소프트웨어를 사용하여 반자동 세포 계수를 수행할 수도 있습니다(그림 9). 면역조직화학 및 리간드 결합은 특정 달팽이관 구조를 염색하는 데 사용할 수 있으며, 이러한 구조는 세포달팽이관 생성과 같은 형태학적 평가를 위해 다른 달팽이관 구조에서 분리할 수 있습니다(그림 10). 모든 달팽이관 구조의 길이, 너비, 표면, 부피 및 개수를 3D 모델에서 확인할 수 있으므로 이 접근 방식은 달팽이관 손상을 기능 장애에 매핑하는 데 이상적입니다. 특히, 노화, 소음으로 인한 외상 또는 기타 손상으로 인한 달팽이관 손상은 2D 광학 섹션의 3D 달팽이관 재구성으로 표시되고 정량화될 수 있습니다. 달팽이관이 디지털화되면 해부학적 레지스트리에서 달팽이관 내 조직의 달팽이관 손상을 다른 달팽이관 조직에 평가하는 데 사용할 수 있는 수많은 이미징 알고리즘이 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
달팽이관 구조 검사를 위한 광시트 현미경에 의한 광학 절편은 다른 전통적인 조직학적 방법처럼 기계적으로 파괴적이지 않으며 서로에 대한 달팽이관 구조에 대한 완전한 디지털 보기를 제공합니다. Corti14 기관의 표면 준비와 같은 이전 방법은 기저막의 길이를 따라 유모 세포 손실 지도를 제공했지만 조직이 해부되어 Corti 기관이 드러났기 때문에 SGN 손실을 평가할 수 없었습?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 국립 보건원 (National Institutes of Health)의 청각 장애 및 기타 의사 소통 장애 연구소 (National Institute on Deafness and Other Communication Disorders), 켈로그 재단 (Kellogg Foundation)의 보조금과 브리짓 스펄 (Bridget Sperl)과 존 맥코믹 (John McCormick)의 개인 기부금으로 지원되었습니다. TSLIM은 독일 일메나우 공과대학교의 Matthias Hillenbrand, Kerstin John, Meike Lawin, Michel Layher, Tobias Schroeter, Peter Schacht, Oliver Dannberg 및 Julian Wuester의 멘토(Stefan Sinzinger 및 Rene Theska)와 James Leger의 탁월한 지원으로 개발되었습니다.
Materials
| Amira 3D Rendering Software | ThermoFisher Scientific | Address: 501 90th Ave NW, Coon Rapids, MN 55433 | |
| benzyl benzoate (W213810) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Bondic | Bondic | Address: 235 Industrial Parkway S., Unit 18 Aurora, ON L4G 3V5 Canada | |
| Ethanol 95% and 100% | University of Minnesota | Address: General Storehouse, Minneapolis, MN 55455 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) (E5134) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| LabVIEW graphical program and Vision | National Instruments | Address: 11500 N Mopac Expwy Austin, TX 78759-3504 | |
| methyl salicylate (M6742) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Olympus MVX10 dissection microscope | Olympus Corp | Address: 3500 Corporate Parkway, Center Valley, PA 18034 | |
| Rhodamine B isothiocynate, (283924) | Sigma-Aldrich, Inc. | Address: PO Box, 14508, St. Louis, MO 68178 | |
| Starna Flurometer Cell (3-G-20) | Starna Cells | Address: PO Box 1919, Atascadero, CA 82423 |
Referências
- Deafness and hearing loss. World Health Organization Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/deafness-and-hearing-loss (2021)
- Vater, M., Kössl, M. Comparative aspects of cochlear functional organization in mammals. Hearing Research. 273 (1-2), 89-99 (2011).
- Santi, P. A., Blair, A., Bohne, B. A., Lukkes, J., Nietfeld, J. The digital cytocochleogram. Hearing Research. 192 (1-2), 75-82 (2004).
- Voie, A. H., Burns, D. H., Spelman, F. A. Orthogonal-plane fluorescence optical sectioning: three-dimensional imaging of macroscopic biological specimens. Journal of Microscopy. 170, 229-236 (1993).
- Voie, A. H., Spelman, S. A. Three-dimensional reconstruction of the cochlea from two-dimensional images of optical sections. Computerized Medical Imaging and Graphics. 19 (5), 377-384 (1995).
- Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy. Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).
- Santi, P. A. Light sheet fluorescence microscopy: a review. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 59 (2), 129-138 (2011).
- Santi, P. A., et al. Thin-sheet laser imaging microscopy for optical sectioning of thick tissues. BioTechniques. 46 (4), 287-294 (2009).
- Schröter, T. J., Johnson, S. B., John, K., Santi, P. A. Scanning thin-sheet laser imaging microscopy (sTSLIM) with structured illumination and HiLo background rejection. Biomedical Optics Express. 3 (1), 170-177 (2012).
- Keller, P. J., Schmidt, A. D., Wittbrodt, J., Stelzer, E. H. K. Reconstruction of zebrafish early embryonic development by scanned light sheet microscopy. Science. 322 (5904), 1065-1069 (2008).
- Buytaert, J. A. N., Dirckx, J. J. J. Design and quantitative resolution measurements of an optical virtual sectioning three-dimensional imaging technique for biomedical specimens, featuring two-micrometer slicing resolution. Journal of Biomedical Optics. 12 (1), 014039 (2007).
- Spalteholz, W. . On making human and animal preparations transparent. , (1914).
- Johnson, S., Schmitz, H., Santi, P. TSLIM imaging and a morphometric analysis of the mouse spiral ganglion. Hearing Research. 278 (1-2), 34-42 (2011).
- Santi, P. A. Organ of Corti surface preparations for computer-assisted morphometry. Hearing Research. 24 (3), 179-187 (1986).
- Brown, D., Pastras, C., Curthoys, I., Southwell, C., Van Roon, L. Endolymph movement visualized with light sheet fluorescence microscopy in an acute hydrops model. Hearing Research. 339, 112-124 (2016).
- White, J. A., Burgess, B. J., Hall, R. D., Nadol, J. B. Pattern of degeneration of the spiral ganglion cell and its processes in the C57BL/6J mouse. Hearing Research. 141 (1-2), 12-18 (2000).
- Grierson, K. E., Hickman, T. T., Liberman, M. C. Dopaminergic and cholinergic innervation in the mouse cochlea after noise-induced or age-related synaptopathy. Hearing Research. 422, 108533 (2022).
