Um protocolo baseado em placa de microtitulação de 96 poços usando um ensaio de redução de 2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-carboxanilidade-2H-tetrazólio (XTT) é descrito neste documento, para estudar os efeitos de anticorpos em biofilmes formados por C. tropicalis. Este protocolo in vitro pode ser usado para verificar o efeito de potenciais novos compostos antifúngicos sobre a atividade metabólica de células de espécies de Candida em biofilmes.
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Artigo de método
Um ensaio de redução solúvel à base de tetrazólio para avaliar o efeito de anticorpos em biofilmes de Candida tropicalis
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
As espécies de Candida são a quarta causa mais comum de infecções nosocomiais sistêmicas. A candidíase sistêmica ou invasiva frequentemente envolve a formação de biofilme em dispositivos implantados ou cateteres, o que está associado ao aumento da virulência e mortalidade. Biofilmes produzidos por diferentes espécies de Candida exibem maior resistência contra várias drogas antifúngicas. Portanto, há uma necessidade de desenvolver imunoterapias eficazes ou tratamentos adjuvantes contra biofilmes de Candida. Embora o papel da imunidade celular esteja bem estabelecido na proteção anti-Candida, o papel da imunidade humoral tem sido estudado menos.
Foi levantada a hipótese de que a inibição da formação e maturação de biofilme é uma das principais funções dos anticorpos protetores, e os anticorpos do tubo germinativo de Candida albicans (CAGTA) demonstraram suprimir o crescimento in vitro e a formação de biofilme de C. albicans mais cedo. Este artigo descreve um protocolo detalhado para avaliar o papel de anticorpos em biofilmes formados por C. tropicalis. A metodologia para este protocolo envolve a formação de biofilme de C. tropicalis em placas de microtitulação de 96 poços, que foram então incubadas na presença ou ausência de anticorpos antígeno-específicos, seguidas por um ensaio de 2,3-bis(2-metoxi-4-nitro-5-sulfofenil)-5-carboxanilide-2H-tetrazólio (XTT) para medir a atividade metabólica de células fúngicas no biofilme.
A especificidade foi confirmada pelo uso de controles séricos apropriados, incluindo soro depletado de anticorpos específicos de Sap2. Os resultados demonstram que os anticorpos presentes no soro de animais imunizados podem inibir a maturação in vitro do biofilme de Candida. Em resumo, este artigo fornece informações importantes sobre o potencial dos anticorpos no desenvolvimento de novas imunoterapias e tratamentos sinérgicos ou adjuvantes contra biofilmes durante a candidíase invasiva. Este protocolo in vitro pode ser usado para verificar o efeito de potenciais novos compostos antifúngicos sobre a atividade metabólica de células de espécies de Candida em biofilmes.
Introdução
A candidíase sistêmica é a quarta principal causa de infecções nosocomiais, que estão associadas a altas taxas de morbidade e mortalidade em todo o mundo. Globalmente, a candidíase sistêmica afeta aproximadamente 700.000 indivíduos1. Espécies de Candida, a saber, C. albicans, C. tropicalis, C. parapsilosis, C. glabrata e C. auris, são a causa mais comum de infecções invasivas por Candida 2. As espécies de Candida são patógenos oportunistas que produzem biofilmes3. Os biofilmes estão predominantemente associados à virulência de....
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Protocolo
Camundongos BALB/c foram alojados no Small Animal Facility no IIT Roorkee. Todos os animais foram mantidos em um ciclo claro:escuro de 12 h:12 h a 25 °C e receberam dieta de pellets e água ad libitum. Todos os procedimentos em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Ética Animal (IAEC) do IIT Roorkee.
1. Preparação de C. tropicalis
NOTA: O fungo Candida tropicalis pertence aos patógenos do Grupo de Risco 2 e é classificado como um microrganismo BSL2. Sempre use armários de segurança biológica de classe II certificados ao trabalhar com espécies de Candida<....
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Resultados
Os biofilmes de Candida tropicalis foram cultivados em placas de microtitulação de 96 poços e fotografados a 40x utilizando microscópio invertido (Figura 1A). O biofilme foi ainda corado com cristal violeta e observado a 40x com microscópio invertido (Figura 1B). A microscopia eletrônica de varredura mostra uma imagem representativa do biofilme de C. tropicalis (Figura 1C). Para a realização do ensaio de inibição d.......
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Discussão
As infecções fúngicas causadas por espécies de Candida estão associadas a altas taxas de morbidade e mortalidade em todo o mundo. A crescente ameaça de infecção fúngica invasiva requer o manejo precoce de tais doenças com risco de vida. A maioria das infecções por Candida envolve a formação de biofilmes, que aderem a uma variedade de dispositivos médicos e são responsáveis pela persistência e recorrência de infecções fúngicas em ambientes hospitalares31. Os biofilmes são composto.......
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Divulgações
Os autores declaram não haver conflitos de interesse.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado pela bolsa Ramalingaswami DBT-843-BIO (Departamento de Biotecnologia, Governo da Índia) e pelo Prêmio de Pesquisa em Início de Carreira SER-1058-BIO (Conselho de Pesquisa em Ciência e Engenharia, Governo da Índia) para a SR. Os autores reconhecem uma subvenção ICMR-JRF para P.C e DBT-JRF para P.S. Os autores agradecem ao Dr. Ravikant Ranjan pelas sugestões sobre o manuscrito e assistência técnica do Sr. Pradeep Singh Thakur durante o MEV.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Tubos de centrífuga cônicos de 15 mL | BD Falcon | 546021 | |
| 1x PBS-Preparado | em laboratório | NaCl : 4 g KCl : 0,1 g Na2HPO4: 0,72 g KH2PO4 : 0,12 g Água 500 mL. Ajuste o pH para 7,4 | |
| tubos de centrífuga cônicos de 50 mL BD | Falcon | 546041 | |
| placas de microtitulação de 96 poços | Incubadora de | 442404 | |
| Genérico | |||
| Menadione | Sigma | M5625 | |
| Microtiter Plate | |||
| Pipeta multicanal e pontas | Genérico | ||
| Placas de Petri | Tarson | 460090 | |
| Ringers Lactato | preparado | em laboratório | cloreto de sódio 0,6 g lactato de sódio 0,312 g cloreto de potássio 0,035 g cloreto de cálcio 0,027 g Água 100 mL. Ajuste para pH 7.0 |
| RPMI 1640 MOPS | Himedia | AT180 | |
| Sabouraud dextrose Agar | SRL | 24613 | |
| Sabouraud dextrose Caldo | SRL | 24835 | |
| XTT | Invitrogen | X6493 |
Referências
- Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R. O., Denning, D. W. Global and multi-national prevalence of fungal diseases-estimate precision. Journal of Fungi. 3 (4), 57(2017).
- Pappas, P., Lionakis, M., Arendrup, M., Ostrosky-Zeichner, L., Kullberg, B. J. Invasive candidiasis. Nature Reviews Disease Pri....
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Reimpressões e permissões
