イン・ビトロ 結膜杯細胞の性差を研究する方法
Summary
フェノールレッドフリー/ウシ胎児血清フリー培地は、性差の研究において結膜杯細胞の正常な機能を変えることなく外因性ホルモンを排除するための高度なRPMIよりも優れた選択肢です。
Abstract
ドライアイは、眼の表面の健康に影響を与える多因子性疾患であり、女性で非常に高い有病率があります。結膜杯細胞(CGC)によって眼表面に分泌されるゲル形成ムチンの破壊は、複数の眼表面疾患の一因となります。外因性性ホルモンの除去は、CGCの性差のin vitro研究中に一貫した結果を得るために不可欠です。この論文では、CGCの生理学的機能を維持しながら、CGCの性差の研究において外因性ホルモンの存在を最小限に抑える方法について説明します。死後ヒトの男女ドナー由来のCGCを、10%ウシ胎児血清(FBS)(完全培地と呼ぶ)を含むRPMI培地で結膜片からコンフルエントになるまで培養した。実験開始の約48時間前に、CGCをフェノールレッドまたはFBSを含まず、1%BSA(フェノールレッドフリー培地と呼ぶ)を含むRPMI培地に移しました。正常な細胞機能は、fura 2/アセトキシメチル(AM)顕微鏡を使用してカルバコール(Cch、1 x 10-4 M)刺激後の細胞内[Ca2+]([Ca2+]i)の増加を測定することによって研究されました。結果は、CGCがフェノールレッドフリー培地中で48時間後に正常な機能を維持したことを示しています。Cch刺激によるフェノール赤色含みRPMI培地と完全培地の間で[Ca2+]i応答に有意差は認められませんでした。したがって、性差の研究においてCGCの正常な機能を変えることなく外因性ホルモンを排除するために、1% BSAを含むフェノールレッドフリーRPMI培地を使用することをお勧めします。
Introduction
性差は眼表面の複数のプロセスに影響を及ぼします1,2,3。これらの性別に基づく違いの臨床症状は、ドライアイや結膜炎など、男性と女性の間の多くの眼表面疾患の有病率の違いです4,5,6。性差は、X染色体とY染色体上の遺伝子のプロファイルの違い7やホルモンの影響8など、複数の生物学的レベルから生じることを示唆する証拠がある。性差の分子基盤を研究することで、病気の理解が深まり、ひいては個別化医療の向上につながります。
眼球表面は、上にある涙液膜、角膜、および結膜で構成されています。性による違いは、涙液膜9,10、角膜11、涙腺12,13、涙腺12、涙腺12など、眼表面の複数の構成要素で観察される。多くのメカニズム研究により、角膜とその関連成分に対する性ホルモンの影響が調査されています14,15。しかし、結膜とその杯細胞の性差についてはほとんど知られていません。結膜は、強膜とまぶたの内面を覆う粘膜です。結膜の上皮は、角質化しない多層層の層状扁平上皮細胞で構成されています16。
結膜の層状扁平上皮細胞の中には、上皮の頂端表面に点在する杯細胞(CGC)があります。これらの杯細胞は、頂端極17に位置する多数の分泌顆粒によって特徴付けられる。CGCは、ゲル形成ムチンMUC5ACを合成して分泌し、眼表面に潤いを与え、まばたき中に滑らかにします17。ムチンの分泌は、細胞内[Ca 2+]([Ca 2+]i)とRas依存性細胞外シグナル調節キナーゼ(ERK1/2)の活性化によって厳密に制御されている18。ムチンを分泌できないと、眼表面が乾燥し、病理学的異常が後遺症になります。しかし、炎症を起こした眼の表面では、炎症性メディエーターによって刺激された広範なムチン分泌により、目の粘着性やかゆみが知覚されます19。ムチン分泌が乱れるこれらの状態は、最終的に眼表面の悪化につながります。
眼のムチンの主要な供給源としての杯細胞の役割は長い間認識されてきましたが20、生理学的および病理学的状態の両方におけるムチン調節の性に基づく違いは未発見のままです。 in vitro システムは、ホルモンの影響なしに、または性ホルモンのレベルを正確に制御して杯細胞の機能を監視するのに役立ちます。結膜上皮細胞株が発達したにもかかわらず21、機能的なムチン分泌を持つ杯細胞株は存在しない。そこで、開発した初代ヒトCGC培養液を改変し、 in vitro16で性差を解析する方法を確立し、以下のように発表する。
Protocol
Representative Results
Discussion
眼組織の性差を調査することは、片方の性に不釣り合いに影響を及ぼす疾患、特にドライアイやアレルギー性結膜炎のプロセスを理解するのに役立ちます4,5,6。これらの研究には動物モデルを使用できますが、in vivoのヒト細胞との類似性が最も高いため、ヒト組織から直接得られたデータが不可欠です。現在の実験…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、National Eye Institute Grant EY019470(D.A.D)から資金提供を受けています。
Materials
| 0.05% trypsin with 1x EDTA | Gibco (Grand Island, NY) | 25300-054 | |
| 4-(2-hydroxyethyl)-1- piperazineethanesulfonic acid | Fisher Bioreagent (Pittsburgh, PA) | BP310-500 | |
| Advanced RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 12633020 | |
| carbachol | Cayman Chemical (Ann Arbor, MI) | 144.86 | |
| Fetal Bovin Serum | R&D (Minneapolis, MN) | S11150H | |
| Fura-2- acetoxymethyl ester | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | F1221 | |
| Human conjunctival tissue | Eversight Eye Bank (Ann Arbor, MI) | N/A | |
| inorganic salt for KRB buffer | Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) | Any brand will work | |
| L-glutamine | Lonza Group (Basel, Switzerland) | 17-605F | |
| non-essential amino acids | Gibco (Grand Island, NY) | 11140-050 | |
| penicillin/streptomycin | Gibco (Grand Island, NY) | 15140-122 | |
| phenol red-free RPMI media | Gibco (Grand Island, NY) | 11835055 | |
| Pluronic acid F127 | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | P2443-250G | |
| RPMI-1640 culture medium | Gibco (Grand Island, NY) | 21875034 | |
| scalpel | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA) | 12460451 | Any sterile surgical scalpel can work |
| sodium pyruvate | Gibco (Grand Island, NY) | 11360-070 | |
| sulfinpyrazone | MilliporeSigma (Burlington, MA, USA) | S9509-5G |
Referências
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