红外热成像用于检测棕色脂肪组织活性的变化

Summary

在这里，我们提出了一种测量人类和实验动物餐后棕色脂肪组织活性的方案。

Abstract

通过正电子发射断层扫描计算机断层扫描（PET-CT）通过餐后或肥胖或糖尿病患者积累^的18F-氟脱氧葡萄糖（FDG）来测量棕色脂肪组织（BAT）活性，作为首选方法失败。主要原因是¹⁸F-FDG与餐后高血糖血浆浓度竞争BAT细胞膜上相同的葡萄糖转运蛋白。此外，BAT也使用脂肪酸作为能量来源，这在PET-CT中是不可见的，并且可以随着肥胖和糖尿病患者的葡萄糖浓度而改变。因此，为了估计BAT在动物和人类中的生理重要性，应用了最近出版物中使用的一种新的红外热成像方法。

禁食过夜后，通过人类志愿者和雌性野生型小鼠餐前和饭后的红外热成像测量BAT活性。相机软件使用与物体的距离、皮肤发射率、反射室温、空气温度和相对湿度来计算物体的温度。在小鼠中，BAT上方的剃光区域是测量平均和最大温度的感兴趣区域。雌性小鼠的发情周期阶段是在用甲酚紫（0.1%）染色溶液染色的阴道涂片实验后确定的。在健康志愿者中，选择了颈部的两个皮肤区域：锁骨上区域（锁骨上方，存在BAT细胞）和锁骨间区域（锁骨之间，没有检测到BAT组织）。BAT 活动由这两个值的减法确定。此外，可以在动物和人类参与者中确定皮肤区域的平均和最大温度。

通过红外热成像（一种非侵入性和更灵敏的方法）测量的餐后BAT活性的变化被证明是实验动物的性别，年龄和发情周期的阶段。作为饮食诱导的产热的一部分，人类的BAT激活也被证明与性别，年龄和体重指数有关。进一步确定餐后BAT活性的病理生理变化对于高葡萄糖血浆浓度（肥胖和糖尿病2型）以及不同实验动物（敲除小鼠）的参与者非常重要。这种方法也是确定可能激活BAT活性的药物的可变工具。

Introduction

与白色脂肪组织（WAT）相比，棕色脂肪组织（BAT）不储存而是消耗能量。在交感神经刺激下，BAT利用脂肪酸和葡萄糖，并通过激活解偶联蛋白1（UCP1）产生热量。UCP1的功能是利用两个线粒体膜之间的H⁺梯度来产生热量，而不是ATP。BAT的功能是在寒冷条件下增加热量产生，从而导致能量消耗增加¹。冷暴露后，来自皮肤的感觉输入抑制下丘脑视前区 （POA） 正中视前 （MnPO） 核中的热敏感神经元，从而降低 POA 神经元对苍白嘴 （rRPa） 的抑制作用。rRPa神经元的激活增加交感神经活性，随后BAT^活性增加2^，3。冷诱导的BAT激活可改善人类的胰岛素敏感性⁴，并且在体重指数（BMI）增加和^年龄为1，⁵，^6，7的人类中^，这种活性降低。

除了在冷诱导产热中的作用外，饭后，英蝙蝠对瘦男性人群的葡萄糖摄取增加，有助于饮食诱导的产热（DIT），这在BAT^{阳性男性受试者}中更高8^，9。用于测量BAT活性的最先进技术是正电子发射断层扫描计算机断层扫描，称为PET-CT。该方法通过测量放射性示踪剂氟脱氧葡萄糖（¹⁸F-FDG）的积累来确定BAT活性。然而，PET-CT作为检测餐后BAT激活的首选方法失败。原因之一是，餐后，¹⁸F-FDG与餐后高血糖竞争相同的葡萄糖转运蛋白，这使得它不适合确定餐后BAT激活，特别是在比较健康和糖尿病参与者的BAT活性时血糖浓度可能存在差异。此外，BAT使用脂肪酸作为热量产生的能量来源，这是PET-CT所不可见的。¹⁸餐后蝙蝠中的F-FDG积累几乎看不见¹⁰，因此在大多数情况下被解释为阴性结果。不出所料，最近有人提出，BAT的激活在人群中比我们以前想象的更明显;因此，有必要采用一种新的方法来检测BAT活性及其参与代谢紊乱⁷。解决这个问题的尝试是用磁共振成像（MRI）测量糖尿病前期患者和具有胰岛素抵抗的2型糖尿病（T2DM）患者的BAT体积¹¹。然而，通过MRI测量的BAT体积不足以估计BAT的日常功能和葡萄糖和脂肪酸的使用。因此，为了估计健康与T2DM患者BAT活性的实际差异，需要一种新的方法，为找出T2DM患者BAT功能障碍的病理机制提供可能性。

为了确定BAT的激活，我们使用红外（IR）热成像技术测量了餐前和饭后的BAT热量产生（图1）^12，13。将红外热成像技术作为测量健康和肥胖个体或糖尿病患者餐后BAT活性的首选方法，将对现场产生巨大影响。时至今日，红外热成像仍用于测定 BAT^13、14、15 的冷诱导活化。在近代人类历史上，寒冷引起的BAT活动不再非常明显（由于栖息地的适当加热，适当的衣服），而饭后BAT激活每天都在发生。此外，这两种BAT功能通过下丘脑的生理调节是完全不同的。饭后，下丘脑弓形核（Arc）中表达前黑皮质素（POMC）的神经元的激活导致交感神经活动通过rRPa¹⁶增加。通过红外热成像或PET-CT测量的冷诱导的BAT活化在用作日常BAT活动的测量时是不合适的。餐后BAT活性增加之后是葡萄糖利用，这对于维持葡萄糖稳态，胰岛素敏感性和葡萄糖浓度的日常调节最终很重要。餐后BAT激活导致餐后葡萄糖消耗增加，随后热量产生和体温（DIT）增加。这被证明是性别，年龄和BMI依赖¹²。在雄性和雌性实验室小鼠中观察到餐后BAT激活的相似性别差异¹⁷。这些发现对应于Burke等人最近发现的BAT调节的性别差异，他们表明通过POMC神经元亚群对BAT褐变的下丘脑调节在雄性和雌性小鼠中有所不同¹⁸。女性、老年人群和肥胖人群中 BAT 的餐后激活较小。餐后缺乏BAT激活（葡萄糖利用率降低）可能导致女性糖耐量受损的患病率更高¹⁹，^20，21，22。不幸的是，大多数关于BAT激活的研究只在男性身上进行。通过在饭后激活BAT，瘦男性人群的葡萄糖摄取增加。毫不奇怪，在BAT激活后，BAT阳性^{男性受试者的}DIT更高8^，9。此外，雄性小鼠的BAT移植改善了葡萄糖耐量，增加了胰岛素敏感性，并降低了体重和脂肪量²³。

PET-CT作为测量BAT活性的首选方法失败，尤其是在饭后。因此，开发了一种非侵入性和更敏感的方法。红外热成像能够估计不同实验动物（敲除小鼠）以及人类参与者的BAT活性，无论性别，年龄或不同病理条件对BAT活性的影响如何。这种方法的另一个好处是参与者和实验动物的简单性，这使我们能够估计BAT加强治疗的潜在益处。最近使用红外热成像来确定寒冷暴露或用餐后BAT生理行为的研究在最近发表的Brasil等人²⁴中有所描述。

Protocol

所有实验动物实验程序均已获得国家伦理委员会和农业部的批准（EP 185/2018）。实验是根据克罗地亚实验动物科学学会的伦理法典和ARRIVE指南进行的。在涉及人类受试者的研究中执行的所有程序均符合赫尔辛基宣言，并经萨格勒布大学医学院伦理委员会批准（UP/I-322-01/18-01/56）。在这项研究中，我们展示了三位女性参与者的结果（BMI：29 kg/m 2 ± 5 kg/m2）。获得所有人类志愿者的知情…

Representative Results

确定BAT活性的最简单方法是减去人类受试者饭前和饭后高于BAT的最大皮肤温度。计算BAT活性的更好方法是选择两个感兴趣的区域：BAT上方的皮肤区域，位于锁骨上区域，以及皮肤锁骨间区域，其中人类没有发现BAT组织，指定为参考区域（根据PET-CT;图1）。然后通过减去这两个温度很容易确定BAT活性。如图1所示，确定BAT活性为1.8°C。 为了确定喂食后BAT的…

Discussion

最近的研究提供了越来越多的证据表明，成年人类和动物的生理调节和BAT活性在肥胖和糖尿病发展中的重要性。此外，外源性激活剂可能激活的BAT正在成为制药公司的目标。为了能够估计BAT在非常繁重的疾病中的生理调节和病理生理重要性，以及发现潜在的治疗方法，红外热成像正在成为首选方法。尽管红外技术正在成为测量BAT活性^12，13，14，…

Materials

0.1% cresyl violet acetate	Commonly used chemical
Device for measuring air temperature and humidity	Kesterl	Kestrel 4200	Certificat of conformity
External data storage	Hard Drive with at least 1 TB
Glass microscopic slides	Commonly used
Small cotton tip swab	Urethral swabs
Software for analysis	FLIR Systems, Wilsonville, OR, USA	FLIR Tools
Software for meassurements	FLIR Systems, Wilsonville, OR, USA	ResearchIR software	FLIR ResearchIR Max, version 4.40.12.38 (64-bit)
Thermac Camera	FLIR Systems, Wilsonville, OR, USA	FLIR T-1020