Termografia a infrarossi per la rilevazione di cambiamenti nell'attività del tessuto adiposo bruno

Summary

Qui, presentiamo un protocollo per misurare l’attività del tessuto adiposo bruno dopo un pasto negli esseri umani e negli animali da laboratorio.

Abstract

La misurazione dell’attività del tessuto adiposo bruno (BAT) mediante tomografia computerizzata ad emissione di positroni (PET-CT) attraverso l’accumulo di ¹⁸F-fluorodesossiglucosio (FDG) dopo un pasto o in pazienti obesi o diabetici fallisce come metodo di scelta. La ragione principale è che ¹⁸F-FDG compete con l’alta concentrazione plasmatica di glucosio postprandiale per lo stesso trasportatore di glucosio sulla membrana delle cellule BAT. Inoltre, BAT utilizza anche acidi grassi come fonte di energia, che non è visibile con PET-CT e potrebbe essere modificata insieme alla concentrazione di glucosio nei pazienti obesi e diabetici. Pertanto, per stimare l’importanza fisiologica delle BAT negli animali e nell’uomo, viene applicato un nuovo metodo di termografia a infrarossi utilizzato in recenti pubblicazioni.

Dopo il digiuno notturno, l’attività BAT è stata misurata mediante termografia a infrarossi prima e dopo un pasto in volontari umani e topi selvatici femmina. Il software della fotocamera calcola la temperatura dell’oggetto utilizzando la distanza dall’oggetto, l’emissività della pelle, la temperatura ambiente riflessa, la temperatura dell’aria e l’umidità relativa. Nei topi, l’area rasata sopra il BAT era una regione di interesse per la quale sono state misurate le temperature medie e massime. La fase del ciclo estrale nei topi femmina è stata determinata dopo un esperimento con strisci vaginali colorati con soluzione di colorazione di viola cresil (0,1%). Nei volontari sani, sono state selezionate due aree cutanee del collo: l’area sopraclavicolare (sopra la clavicola, dove sono presenti le cellule BAT) e l’area interclavicolare (tra le clavicole, dove non è stato rilevato tessuto BAT). L’attività BAT è determinata dalla sottrazione di questi due valori. Inoltre, le temperature medie e massime delle aree della pelle potrebbero essere determinate negli animali e nei partecipanti umani.

I cambiamenti nell’attività BAT dopo un pasto misurati dalla termografia a infrarossi, un metodo non invasivo e più sensibile, hanno dimostrato di essere sesso, età e fase del ciclo estrale dipendenti negli animali da laboratorio. Come parte della termogenesi indotta dalla dieta, l’attivazione delle BAT negli esseri umani ha anche dimostrato di dipendere dal sesso, dall’età e dall’indice di massa corporea. Determinare ulteriormente i cambiamenti fisiopatologici nell’attività BAT dopo un pasto sarà di grande importanza per i partecipanti con alte concentrazioni plasmatiche di glucosio (obesità e diabete mellito di tipo 2), nonché in diversi animali da laboratorio (topi knock-out). Questo metodo è anche uno strumento variabile per determinare possibili farmaci attivanti che potrebbero ringiovanire l’attività delle BAT.

Introduction

Il tessuto adiposo bruno (BAT), a differenza del tessuto adiposo bianco (WAT), non immagazzina ma piuttosto spende energia. Dopo la stimolazione simpatica, BAT utilizza acidi grassi e glucosio e produce calore mediante l’attivazione della proteina disaccoppiante 1 (UCP1). La funzione di UCP1 è quella di utilizzare un gradiente H ⁺ tra due membrane mitocondriali per produrre calore invece di ATP. La funzione delle BAT è quella di aumentare la produzione di calore in condizioni di freddo, il che porta ad un aumento del dispendio energetico¹. Dopo l’esposizione al freddo, gli input sensoriali dalla pelle inibiscono i neuroni sensibili al caldo nel nucleo preottico mediano (MnPO) dell’area preottica ipotalamica (POA), che diminuisce l’effetto inibitorio dei neuroni POA sul raphe pallido rostrale (rRPa). L’attivazione dei neuroni rRPa aumenta l’attività simpatica, seguita da un aumento dell’attività BAT ^2,3. L’attivazione BAT indotta dal freddo migliora la sensibilità all’insulina nell’uomo⁴ e questa attività è diminuita negli esseri umani con aumento dell’indice di massa corporea (BMI) e dell’età 1,5,6,7.

Oltre al suo ruolo nella termogenesi indotta dal freddo, dopo un pasto, l’assorbimento di glucosio nella BAT aumenta nella popolazione maschile magra, contribuendo alla termogenesi indotta dalla dieta (DIT), che è più alta nei soggetti maschi BAT positivi ^8,9. La tecnica all’avanguardia utilizzata per misurare l’attività BAT è la tomografia computerizzata ad emissione di positroni, nota come PET-CT. Questo metodo determina l’attività BAT misurando l’accumulo del fluorodesossiglucosio radiotracciante (¹⁸F-FDG). Tuttavia, la PET-CT fallisce come metodo di scelta per rilevare l’attivazione di BAT dopo un pasto. Uno dei motivi è che, dopo un pasto, ¹⁸F-FDG compete con l’iperglicemia postprandiale per lo stesso trasportatore del glucosio, il che lo rende inadatto a determinare l’attivazione di BAT dopo un pasto, specialmente quando si confronta l’attività BAT in partecipanti sani e diabetici con possibili differenze nelle concentrazioni di glucosio nel sangue. Inoltre, il BAT utilizza gli acidi grassi come fonte di energia per la produzione di calore che non è visibile con la PET-CT. ¹⁸ L’accumulo di F-FDG in BAT dopo un pasto è appena visibile¹⁰ ed è, quindi, interpretato come un risultato negativo nella maggior parte dei casi. Non sorprende che, recentemente, sia stato suggerito che l’attivazione delle BAT sia più pronunciata nella popolazione umana di quanto si pensasse in precedenza; pertanto, è necessario un nuovo approccio per rilevare l’attività delle BAT e il suo coinvolgimento nei disturbi metabolici⁷. Un tentativo di risolvere questo problema è misurare il volume di BAT con risonanza magnetica (MRI) in pazienti prediabetici e pazienti con diabete mellito di tipo 2 (T2DM) con insulino-resistenza¹¹. Tuttavia, il volume delle BAT misurato mediante risonanza magnetica non è un indicatore sufficiente per stimare la funzione quotidiana e l’utilizzo di glucosio e acidi grassi da parte delle BAT. Pertanto, per stimare le reali differenze nell’attività delle BAT nei pazienti sani rispetto ai pazienti con DMT2, è necessario un nuovo approccio che offra la possibilità di scoprire il meccanismo patologico del malfunzionamento delle BAT nei pazienti con DMT2.

Per determinare l’attivazione del BAT, abbiamo eseguito misurazioni della produzione di calore BAT prima e dopo un pasto utilizzando la termografia a infrarossi (IR) (Figura 1) ^12,13. Stabilire la termografia IR come metodo di scelta per misurare l’attività BAT dopo un pasto in individui sani e obesi o pazienti con diabete mellito avrà un enorme impatto sul campo. Ad oggi, la termografia IR viene utilizzata per la determinazione dell’attivazione indotta dal freddo di BAT^13,14,15. Nella storia umana recente, l’attività BAT indotta dal freddo non è più molto pronunciata (a causa del corretto riscaldamento degli habitat, abbigliamento adeguato), mentre l’attivazione delle BAT dopo un pasto si verifica ogni giorno. Inoltre, la regolazione fisiologica di queste due funzioni BAT attraverso l’ipotalamo è completamente diversa. Dopo un pasto, l’attivazione dei neuroni che esprimono proopiomelanocortina (POMC) nel nucleo arcuato ipotalamico (Arc) porta ad un aumento dell’attività del nervo simpatico tramite rRPa¹⁶. L’attivazione indotta dal freddo di BAT misurata mediante termografia IR o PET-CT è impropria se utilizzata come misura per l’attività quotidiana di BAT. L’aumento dell’attività BAT dopo un pasto è seguito dall’utilizzo del glucosio, che è in definitiva importante per mantenere l’omeostasi del glucosio, la sensibilità all’insulina e la regolazione giornaliera della concentrazione di glucosio. L’attivazione postprandiale della BAT porta ad un aumento del consumo di glucosio postprandiale, seguito da un aumento della produzione di calore e della temperatura corporea (DIT). Questo è stato dimostrato essere sesso, età e BMI dipendente¹². Differenze di genere simili nell’attivazione delle BAT dopo un pasto sono state osservate nei topi di laboratorio maschi e femmine¹⁷. Questi risultati corrispondono alle differenze di genere recentemente scoperte nella regolazione della BAT da Burke et al., che hanno dimostrato che la regolazione ipotalamica del BAT browning attraverso una sottopopolazione di neuroni POMC differisce nei topi maschi e femmine¹⁸. L’attivazione postprandiale della BAT è minore nelle donne, nelle popolazioni anziane e nelle persone obese. La mancanza di attivazione delle BAT dopo un pasto (diminuzione dell’utilizzo del glucosio) potrebbe portare ad una maggiore prevalenza di ridotta tolleranza al glucosio nelle donne 19,20,21,22. Sfortunatamente, la maggior parte degli studi sull’attivazione delle BAT sono stati condotti solo sugli uomini. Attivando la BAT dopo un pasto, l’assorbimento di glucosio aumenta nella popolazione maschile magra. Non sorprende che, dopo l’attivazione della BAT, il DIT sia più alto nei soggetti maschi BAT positivi ^8,9. Inoltre, il trapianto di BAT nei topi maschi migliora la tolleranza al glucosio, aumenta la sensibilità all’insulina e diminuisce il peso corporeo e la massa grassa²³.

La PET-CT fallisce come metodo di scelta per misurare l’attività delle BAT, specialmente dopo un pasto. Pertanto, è stato sviluppato un metodo non invasivo e più sensibile. La termografia IR consente di stimare l’attività delle BAT in diversi animali da laboratorio (topi knock-out), nonché in partecipanti umani, indipendentemente dal sesso, dall’età o dagli effetti di diverse condizioni patologiche sull’attività delle BAT. Un ulteriore vantaggio di questo metodo è la semplicità per i partecipanti e gli animali da laboratorio, che ci consente di stimare i potenziali benefici della terapia di richiamo BAT. I recenti studi che utilizzano la termografia IR per determinare il comportamento fisiologico del BAT dopo l’esposizione al freddo o un pasto sono descritti nella recente pubblicazione di Brasil et ^al.24.

Protocol

Tutte le procedure sperimentali su animali da laboratorio sono state approvate dal Comitato Etico Nazionale e dal Ministero dell’Agricoltura (EP 185/2018). Gli esperimenti sono stati condotti in conformità con il Codice etico della Società croata per la scienza degli animali da laboratorio e le linee guida ARRIVE. Tutte le procedure eseguite negli studi che coinvolgono partecipanti umani erano conformi alla Dichiarazione di Helsinki e approvate dal Comitato Etico dell’Università di Zagabria, Facoltà di Medicina (UP/I…

Representative Results

Il modo più semplice per determinare l’attività delle BAT è sottrarre la temperatura massima della pelle al di sopra della BAT prima e dopo un pasto nei soggetti umani. Un modo migliore per calcolare l’attività delle BAT è selezionare due regioni di interesse: l’area cutanea sopra il BAT, che si trova nell’area sopraclavicolare, e l’area interclavicolare della pelle in cui non si trova tessuto BAT nell’uomo, designata come area di riferimento (secondo PET-CT; Figura 1). L’attività BAT …

Discussion

Studi recenti presentano prove crescenti per quanto riguarda la regolazione fisiologica e l’importanza dell’attività delle BAT nell’uomo adulto e negli animali nello sviluppo dell’obesità e del diabete mellito. Inoltre, la possibile attivazione delle BAT da parte di attivatori esogeni sta diventando un obiettivo per le aziende farmaceutiche. Per poter stimare la regolazione fisiologica e l’importanza fisiopatologica delle BAT in patologie molto gravose, nonché scoprire un potenziale approccio terapeutico, la termograf…

Materials

0.1% cresyl violet acetate	Commonly used chemical
Device for measuring air temperature and humidity	Kesterl	Kestrel 4200	Certificat of conformity
External data storage	Hard Drive with at least 1 TB
Glass microscopic slides	Commonly used
Small cotton tip swab	Urethral swabs
Software for analysis	FLIR Systems, Wilsonville, OR, USA	FLIR Tools
Software for meassurements	FLIR Systems, Wilsonville, OR, USA	ResearchIR software	FLIR ResearchIR Max, version 4.40.12.38 (64-bit)
Thermac Camera	FLIR Systems, Wilsonville, OR, USA	FLIR T-1020