Um método de enriquecimento para pequenas vesículas extracelulares derivadas do tecido de câncer de fígado
Summary
Descrevemos aqui o enriquecimento de pequenas vesículas extracelulares derivadas de tecido de câncer hepático através de um método otimizado de ultracentrifugação diferencial.
Abstract
Pequenas vesículas extracelulares (EVs) derivadas do tecido podem refletir o estado funcional das células-fonte e as características do espaço intersticial do tecido. O enriquecimento eficiente desses sEVs é um pré-requisito importante para o estudo de sua função biológica e uma chave para o desenvolvimento de técnicas de detecção clínica e tecnologia de carreadores terapêuticos. É difícil isolar os sEVs do tecido porque eles geralmente estão fortemente contaminados. Este estudo fornece um método para o enriquecimento rápido de sEVs de alta qualidade do tecido do cancro do fígado. O método envolve um processo de quatro etapas: incubação de enzimas digestivas (colagenase D e DNase Ι) com tecido, filtração através de filtro celular de 70 μm, ultracentrifugação diferencial e filtração através de filtro de membrana de 0,22 μm. Devido à otimização da etapa de ultracentrifugação diferencial e à adição de uma etapa de filtração, a pureza dos sEVs obtidos por este método é maior do que a obtida pela ultracentrifugação diferencial clássica. Ele fornece uma metodologia importante e dados de apoio para o estudo de sEVs derivados de tecido.
Introduction
Pequenas vesículas extracelulares (EVs) têm aproximadamente 30 nm a 150 nm de diâmetro e são secretadas por várias células1. Eles podem se comunicar com as células do tecido e regular o microambiente local ou distante, transportando moléculas biológicas importantes, como lipídios, proteínas, DNA e RNA para vários órgãos, tecidos, células e partes intracelulares. Assim, também podem alterar o comportamento das células receptoras 2,3. O isolamento e purificação de sEVs específicos é um pré-requisito essencial para estudar seu comportamento biológico durante o desenvolvimento e curso da doença. A ultracentrifugação diferencial, considerada padrão-ouro, é comumente usada para separar os EVs dos tecidos nos quais normalmente residem4. Restos teciduais, restos celulares, grandes vesículas e corpos apoptóticos podem ser removidos por essa técnica, restando apenas os sEVs.
Demonstrou-se que a colagenase D e a DNase I não afetam as características moleculares das células ou vesículas, sendo que as propriedades de ambas as enzimas contribuem para a liberação de vesículas na matriz extracelular 5. Essas enzimas têm sido utilizadas para extrair EVs de melanoma metastático humano, tecido de câncer de cólon e tecido da mucosa colônica 5,6,7. Entretanto, a concentração e o tempo de digestão da colagenase D e DNase I nesses métodos diferem, levando a conclusões inconsistentes. Para evitar a coprecipitação de outros subtipos de sEVs, pesquisadores removeram vesículas extracelulares maiores (0,1 μm ou 0,2 μm de diâmetro) por filtração e/ou centrifugação diferencial8. Dependendo do tecido fonte, diferentes métodos de isolamento e purificação podem ser necessários 9,10.
O uso do método tradicional de ultracentrifugação diferencial para extrair sEVs do tecido hepático resulta em uma camada de substância branca na superfície do sobrenadante, sem qualquer maneira de determinar suas propriedades. Em um estudo anterior11, essa camada de substância branca afetou a pureza dos sEVs. Embora o número de partículas e a concentração de proteínas das amostras isoladas pelo método tradicional tenham sido superiores aos do método atual, o coeficiente de variação foi grande, possivelmente porque muitos poluentes podem levar a uma baixa repetibilidade dos resultados. Ou seja, usando detergente (isto é, detectando a solubilidade de partículas em Triton X-100 a 1%), verificamos que a pureza dos sEVs obtidos por esse método foi maior. Assim, usamos este método para isolar e purificar sEVs derivados de tecido de câncer colorretal para pesquisa proteômica.
Atualmente, as pesquisas sobre sEVs no câncer de fígado estão focadas principalmente no soro, plasma e sobrenadante da cultura celular12,13,14. No entanto, os EVs derivados do tecido do câncer de fígado podem refletir com mais precisão a patologia fisiológica e o microambiente circundante do câncer de fígado e efetivamente evitar a degradação e a poluição de outros EVs15,16. Com o uso de ultracentrifugação diferencial, este método pode enriquecer o rendimento e obter sEVs de alta qualidade, fornecendo uma base importante para o estudo posterior do câncer de fígado. Este método permite que o tecido do câncer de fígado seja separado por separação nítida e seja dissociado pela colagenase D e DNase I. Em seguida, os debris celulares, as grandes vesículas e os corpos apoptóticos são removidos por filtração e ultracentrifugação diferencial. Finalmente, os sEVs são isolados e purificados para estudos posteriores.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo descreve um método repetível para extrair sEVs do tecido de câncer de fígado. Os sEVs de alta qualidade são obtidos por isolamento tecidual nítido, tratamento com enzimas digestivas, ultracentrifugação diferencial e filtração e purificação da membrana filtrante de 0,22 μm. Para a análise a jusante, é extremamente importante garantir a alta pureza dos sEVs. No processo de centrifugação diferencial, uma camada de substâncias brancas (composição desconhecida) aparecerá na superfície do s…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem ao Primeiro Hospital Afiliado da Gannan Medical University por apoiar este trabalho. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (número de bolsa 82260422).
Materials
| 0.22 µm Membrane Filter Unit | Millex | SLGPR33RB | |
| 1 mL Sterile syringe | Hubei Xianming Medical Instrument Company | YL01329 | |
| 2% Uranyl Acetate | Electron Microscopy Sciences | 22400-2 | |
| 4.7 mL Centrifuge Tube | Beckman Coulter | 361621 | |
| 6-well Cell cuture plate | LABSELECT | 11110 | |
| 50 mL Beaker | Tianjin Kangyiheng Experimental Instrument Sales Company | CF2100800 | |
| 70 µm Cell strainer | Biosharp | BS-70-XBS | |
| 100 mm Cell culture dish | CELL TER | CS016-0128 | |
| 600 µL Centrifuge tube | Axygen | MCT060C | |
| BCA protein quantification kit | Thermo Fisher | RJ240544 | |
| Beckman Coulter Optima-Max-TL | Beckman | A95761 | |
| BioRad Mini trans-blot | Bio-Rad | 1703930 | |
| BioRad Mini-Protean | Bio-Rad | 1645050 | |
| CD63 Antibody | Abcam | ab134045 | |
| CD9 Antibody | Abcam | ab263019 | |
| Centrifuge 5430R | Eppendorf | 5428HQ527333 | |
| Cleaning Solution | NanoFCM | C1801 | |
| Collagenase D | Roche | 11088866001 | |
| Copper net | Henan Zhongjingkeyi Technology Company | DJZCM-15-N1 | |
| Dry Thermostat | Hangzhou allsheng instruments company | AS-01030-00 | |
| FITC Anti Human CD9 Antibody | Elabscience | E-AB-F1086C | |
| Glycine | Solarbio | G8200 | |
| Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-mouse antibody | Proteintech | SA00001-1 | |
| Goat horseradish peroxidase (HRP)-coupled secondary anti-rabbit antibody | Proteintech | SA00001-2 | |
| Methanol | Shanghai Zhenxing Chemical Company | ||
| Nanoparticle flow cytometer | NanoFCM INC | FNAN30E20112368 | |
| Phosphatase inhibitors(PhosSTOP) | Roche | 4906845001 | |
| Phosphate Buffered Saline(PBS) | Servicebio | G4202 | |
| Polyvinylidene Difluoride Membrane | Solarbio | ISEQ00010 | |
| QC Beads | NanoFCM | QS2502 | |
| RPMI-1640 basic medium | Biological Industries | C11875500BT | |
| Scalpel | Guangzhou Kehua Trading Company | NN-0623-1 | |
| Silica Nanospheres | NanoFCM | S16M-Exo | |
| Transference Decoloring Shaker TS-8 | Kylin-Bell | E0018 | |
| Transmission Electron Microscope | Thermo Scientific | Talos L120C | |
| Tris | Solarbio | T8060 | |
| TSG101 Antibody | Proteintech | 28283-1-AP | |
| Tweezer | Guangzhou Lige Technology Company | LG01-105-4X |
Referências
- Isaac, R., Reis, F. C. G., Ying, W., Olefsky, J. M. Exosomes as mediators of intercellular crosstalk in metabolism. Cell Metabolism. 33 (9), 1744-1762 (2021).
- Hou, R., et al. Advances in exosome isolation methods and their applications in proteomic analysis of biological samples. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (21), 5351-5361 (2019).
- Zhang, L., Yu, D. Exosomes in cancer development, metastasis, and immunity. Biochimica et Biophysica Acta – Reviews on Cancer. 1871 (2), 455-468 (2019).
- Yang, D., et al. and perspective on exosome isolation – Efforts for efficient exosome-based theranostics. Theranostics. 10 (8), 3684-3707 (2020).
- Crescitelli, R., Lässer, C., Lötvall, J. Isolation and characterization of extracellular vesicle subpopulations from tissues. Nature Protocols. 16 (3), 1548-1580 (2021).
- Crescitelli, R., et al. Subpopulations of extracellular vesicles from human metastatic melanoma tissue identified by quantitative proteomics after optimized isolation. Journal of Extracellular Vesicles. 9 (1), 1722433 (2020).
- Jang, S. C., et al. Mitochondrial protein enriched extracellular vesicles discovered in human melanoma tissues can be detected in patient plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 8 (1), 1635420 (2019).
- Muralidharan-Chari, V., et al. ARF6-regulated shedding of tumor cell-derived plasma membrane microvesicles. Current Biology. 19 (22), 1875-1885 (2009).
- Matejovič, A., Wakao, S., Kitada, M., Kushida, Y., Dezawa, M. Comparison of separation methods for tissue-derived extracellular vesicles in the liver, heart, and skeletal muscle. FEBS Open Bio. 11 (2), 482-493 (2021).
- Zhou, X., et al. Brown adipose tissue-derived exosomes mitigate the metabolic syndrome in high fat diet mice. Theranostics. 10 (18), 8197-8210 (2020).
- Chen, J., et al. Comparison of the variability of small extracellular vesicles derived from human liver cancer tissues and cultured from the tissue explants based on a simple enrichment method. Stem Cell Reviews and Reports. 18 (3), 1067-1077 (2022).
- Fang, T., et al. Tumor-derived exosomal miR-1247-3p induces cancer-associated fibroblast activation to foster lung metastasis of liver cancer. Nature Communications. 9 (1), 1247-1243 (2018).
- Huang, X., et al. RNA sequencing of plasma exosomes revealed novel functional long noncoding RNAs in hepatocellular carcinoma. Cancer Science. 111 (9), 3338-3349 (2020).
- Chen, L., et al. HCC-derived exosomes elicit HCC progression and recurrence by epithelial-mesenchymal transition through MAPK/ERK signalling pathway. Cell Death & Disease. 9 (5), 513 (2018).
- Jingushi, K., et al. Extracellular vesicles isolated from human renal cell carcinoma tissues disrupt vascular endothelial cell morphology via azurocidin. International Journal of Cancer. 142 (3), 607-617 (2018).
- Camino, T., et al. Deciphering adipose tissue extracellular vesicles protein cargo and its role in obesity. International Journal of Molecular Sciences. 21 (24), 9366 (2020).
