ביטוי טרנסגנים באורותליום טבעי של שלפוחית השתן באמצעות התמרה בתיווך אדנו-וירוס
Summary
שיטות מתוארות ליצירת כמויות גדולות של אדנו-וירוסים רקומביננטיים, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש בהם כדי להתמיר את המכרסם המקומי urothelium המאפשר ביטוי של transgenes או downregulation של תוצרי גנים אנדוגניים.
Abstract
בנוסף ליצירת מחסום בעל התנגדות גבוהה, משערים כי השתן המצפה את אגן הכליה, השופכנים, שלפוחית השתן והשופכה הפרוקסימלית חש ומעביר מידע על סביבתו לרקמות שמתחתיו, ומקדם תפקוד והתנהגות של התרוקנות. הפרעה במחסום דרכי השתן, או בתפקוד החושי/מתמר שלו, עלולה להוביל למחלה. חקר האירועים המורכבים האלה נפגע בשל היעדר אסטרטגיות פשוטות לשינוי ביטוי גנים וחלבונים באורותל. מתוארות כאן שיטות המאפשרות לחוקרים לייצר כמויות גדולות של אדנו-וירוס בעל טיטר גבוה, אשר לאחר מכן ניתן להשתמש בו כדי להפוך מכרסם אורותל ביעילות גבוהה, ובאופן פשוט יחסית. הן cDNA והן RNA מפריע קטן יכולים לבוא לידי ביטוי באמצעות התמרה אדנו-ויראלית, ואת ההשפעה של ביטוי טרנסגנים על תפקוד דרכי השתן ניתן להעריך 12 שעות עד כמה ימים מאוחר יותר. לשיטות אלה ישימות רחבה במחקרים של ביולוגיה נורמלית ולא תקינה של דרכי השתן באמצעות מודלים של חיות עכבר או חולדה.
Introduction
האורותל הוא אפיתל מיוחד המרפד את אגן הכליה, השופכנים, שלפוחית השתן והשופכה הפרוקסימלית1. הוא מורכב משלוש שכבות: שכבה של תאי מטריה ממוינים ומקוטבים מאוד, לעתים קרובות דו-גרעיניים, שפני השטח האפיקליים שלהם שטופים בשתן; שכבת תאי ביניים עם אוכלוסייה של תאים מגבירי מעבר דו-גרעיניים שיכולים ליצור תאי מטריה שטחיים בתגובה לאובדנם החריף; ושכבה אחת של תאי בסיס, תת-קבוצה שלהם מתפקדים כתאי גזע שיכולים לחדש את כל דרכי השתן בתגובה לפגיעה כרונית. תאי מטריה אחראים בעיקר ליצירת מחסום דרכי השתן בעל העמידות הגבוהה, שמרכיביו כוללים קרום אפיקלי (עשיר בכולסטרול וצרברוזידים) בעל חדירות נמוכה למים ולמומסים, וקומפלקס צמתים אפיקלי בעל עמידות גבוהה (המורכב מצמתים הדוקים, צמתים נצמדים, דסמוזומים וטבעת אקטומיוזין קשורה)1 . הן פני השטח האפיקליים של תא המטריה והן טבעת הצומת שלו מתרחבים במהלך מילוי שלפוחית השתן וחוזרים למצבם המלא מראש במהירות לאחר התרוקנות 1,2,3,4,5. בנוסף לתפקידו בתפקוד המחסום, משערים כי לאורותלים יש גם תפקודי חישה ומתמרים המאפשרים לו לחוש שינויים בסביבה החוץ-תאית (למשל, מתיחה) ולהעביר מידע זה באמצעות שחרור מתווכים (כולל ATP, אדנוזין ואצטילכולין) לרקמות הבסיסיות,כולל תהליכים עצביים תת-אורותליים 6,7,8 . עדויות עדכניות לתפקיד זה נמצאות בעכברים חסרי ביטוי דרכי השתן הן של Piezo1 והן של Piezo2, מה שגורם לשינוי בפונקציית ההתרוקנות9. בנוסף, חולדות המבטאות יתר על המידה את החלבון CLDN2 יוצר הנקבוביות בשכבת תאי המטריה מפתחות דלקת וכאב דומים לאלה שנצפו בחולים עם דלקת שלפוחית השתן אינטרסטיציאלית10. משערים כי הפרעה בתפקוד החושי/מתמר או מחסום דרכי השתן עשויה לתרום למספר הפרעות בשלפוחית השתן 6,11.
הבנה טובה יותר של הביולוגיה של השתן במצבים נורמליים ובמצבי מחלה תלויה בזמינותם של כלים שיאפשרו לחוקרים להפחית בקלות את ביטוי הגנים האנדוגניים או לאפשר ביטוי של טרנסגנים ברקמה הטבעית. בעוד שגישה אחת להפחתת ויסות ביטוי גנים היא יצירת עכברי נוקאאוט מותנים של דרכי השתן, גישה זו תלויה בזמינות של עכברים עם אללים פלוקסדיים, היא אינטנסיבית ויכולה להימשך חודשים עד שנים כדי להשלים12. באופן לא מפתיע, אם כן, חוקרים פיתחו טכניקות להדביק או להתמיר את האורותל, מה שיכול להוביל לתוצאות בטווח זמן קצר יותר. שיטות שפורסמו לטרנספקציה כוללות שימוש בשומנים קטיוניים13, אוליגודאוקסינוקלאוטידים אנטי-סנס 14, או חומצות גרעין אנטיסנס הקשורות לחלבון HIV TAT החודר לפפטיד 11-mer15. עם זאת, המוקד של פרוטוקול זה הוא על השימוש בטרנסדוקציה בתיווך אדנובירל, מתודולוגיה נחקרת היטב היעילה בהעברת גנים למגוון רחב של תאים, נבדקה בניסויים קליניים רבים, ולאחרונה שימשה להעברת cDNA המקודד את חלבון הקפסיד COVID-19 למקבלי גרסה אחת של חיסון COVID-1916, 17. לתיאור מעמיק יותר של מחזור החיים של אדנווירוס, וקטורים אדנו-ויראליים ויישומים קליניים של אדנווירוסים, הקורא מופנה להפניה17.
אבן דרך חשובה בשימוש באדנו-וירוסים להעברת האורותל, הייתה דו”ח של Ramesh et al. שהראה טיפולים מקדימים קצרים עם דטרגנטים, כולל N-dodecyl-β-D-maltoside (DDM) שיפור דרמטי בהתמרה של האורותליום על ידי אדנווירוס המקודד β-גלקטוזידאז18. באמצעות מחקר הוכחת עיקרון זה כמדריך, התמרה בתיווך אדנובירל של האורותליום שימשה כעת לביטוי מגוון חלבונים, כולל GTPases ממשפחת ראב, גורמי חילוף גואנין-נוקלאוטידים, שברי מנוע מיוזין, קלאודינים הקשורים לצומת הדוק יוצרי נקבוביות, ו- ADAM17 10,19,20,21,22 . אותה גישה הותאמה לבטא רנ”א מפריע קטן (siRNA), שהשפעותיו ניצלו על ידי ביטוי משותף של גרסאות עמידות ל-siRNA של הטרנסגן22. הפרוטוקול המתואר כאן כולל שיטות כלליות ליצירת כמויות גדולות של אדנו-וירוס מרוכז מאוד, דרישה לטכניקות אלה, כמו גם התאמות של השיטות של Ramesh et al.18 כדי לבטא טרנסגנים באורותליום ביעילות גבוהה.
Protocol
Representative Results
Discussion
בעוד ראמש ועמיתיו התמקדו בפיתוח אסטרטגיות לשימוש בהתמרה אדנו-ויראלית בטיפול בסרטן שלפוחית השתן 18, דיווחים עדכניים יותר הדגימו את התועלת של טכניקות אלה בחקר ביולוגיה / פיזיולוגיה של דרכי השתן ופתופיזיולוגיה תקינה 10,18,19,20,21…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי פרס פרויקט פיילוט באמצעות P30DK079307 (ל- M.G.D.), מענק NIH R01DK119183 (ל- G.A. ו- M.D.C.), מענק NIH R01DK129473 (ל- G.A.), פרס פיתוח קריירה של האגודה האמריקאית לאורולוגיה ומענק קרן וינטרס (ל- N.M.), על ידי פיזיולוגיה של התא וליבות הדמיית כליות של אורגניזמים מודל של מרכז פיטסבורג לחקר הכליות (P30DK079307), ועל ידי S10OD028596 (ל-G.A.), שמימנה את רכישת המערכת הקונפוקלית ששימשה ללכידת חלק מהתמונות המוצגות בכתב יד זה.
Materials
| 10 mL pipette | Corning Costar (Millipore Sigma) | CLS4488 | sterile, serological pipette, individually wrapped |
| 12 mL ultracentrifuge tube | ThermoFisher | 06-752 | PET thinwall ultracentrifuge tube |
| 15 mL conical centrifuge tube | Falcon (Corning) | 352097 | sterile |
| 18 G needle | BD | 305196 | 18 G x 1.5 in needle |
| 20 mL pipette | Corning Costar (Millipore Sigma) | CLS4489 | sterile, serological pipette, individually wrapped |
| 50 mL conical centrifuge tube | Falcon (Corning) | 352098 | sterile |
| 5 mL pipette | Corning Costar (Millipore Sigma) | CLS4487 | sterile, serological pipette, individually wrapped |
| Cavicide | Henry Schein | 6400012 | Anti-viral solution |
| Cell culture dish – 15 cm | Falcon (Corning) | 353025 | sterile, tissue-culture treated (150 mm x 25 mm dish) |
| Cell scraper | Sarstedt | 893.1832 | handle length 24 cm, blade length 1.7 cm |
| CsCl | Millipore Sigma | C-4306 | Molecular Biology grade ≥ 98% |
| DMEM culture medium (high glucose) | Gibco (ThermoFisher) | 11965092 | with 4.5 g/L glucose + L-glutamine + phenol red |
| EDTA | Millipore Sigma | EDS | Bioiultra grade ≥ 99% |
| Fetal bovine serum | Hyclone (Cytiva) | SH30070.03 | defined serum |
| Glass pipette | Fisher Scientific | 13-678-20A | 5.75 in glass pipette, autoclaved |
| Glycerol | Millipore Sigma | G-5516 | Molecular Biology grade ≥ 99% |
| HEK293 cells | ATCC | CRL-3216 | HEK293T cells are a variant of HEK293 cells that express the SV40 large T-antigen |
| Isoflurane | Covetrus | 29405 | |
| IV catheter – mouse | Smith Medical Jelco | 3063 | 24 G x 3/4 in Safety IV catheter radiopaque |
| IV catheter – rat | Smith Medical Jelco | 3060 | 22 G x 1 in Safety IV catheter radiopaque |
| KCl | Millipore Sigma | P-9541 | Molecular Biology grade ≥ 99% |
| KH2PO4 | Millipore Sigma | P5655 | Cell culture grade ≥ 99% |
| Na2HPO4•7 H2O | Millipore Sigma | 431478 | ≥ 99.99% |
| NaCl | Millipore Sigma | S3014 | Molecular Biology grade ≥ 99% |
| N-dodecyl-β-D-maltoside | Millipore Sigma | D4641 | ≥ 98% |
| Nose cone for multiple animals | custom designed | commercial options include one from Parkland Scientific (RES3200) | |
| PD-10 column | GE Healthcare | 17-085-01 | Prepacked columns filled ith Sephadex G-25M |
| Penicillin/streptomycin antibiotic (100x) | Gibco (ThermoFisher) | 15070063 | 100x concentrated solution |
| Spectrophotometer | Eppendorf | BioPhotometer | |
| Stand and clamp | Fisher Scientific | 14-679Q and 05-769-8FQ | available from numerous suppliers |
| Sterile filter unit | Fisher Scientific (Nalgene) | 09-740-65B | 0.2 µm rapid-flow filter unit (150 mL) |
| Sterile filter unit 0.2 µm (syringe) | Fisher Scientific | SLGV004SL | Millipore Sigma Milex 0.22 µm filter unit that attaches to syringe |
| Super speed centrifuge | Eppendorf | 5810R | with Eppendorf F34-6-38 fixed angle rotor (12,000 rpm) |
| Syringe (1 mL) | BD | 309628 | 1-mL syringe Luer-lok tip – sterile |
| Syringe (3 mL) | BD | 309656 | 3-mL syringe slip tip – sterile |
| Table-top centrifuge (low speed) | Eppendorf | 5702 | with swinging bucket rotor |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | polyethylene 3.4 mL transfer pipette |
| Tris-base | Millipore Sigma | 648310-M | Molecular Biology grade |
| TrypLE select protease solution | Gibco (ThermoFisher) | 12604013 | TrypLE express enzyme (1x), no phenol red |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima L-80 XP | with Beckman SW41 rotor (41,000 rpm) |
| Vaporizer | General Anesthetic Services, Inc. | Tec 3 | Isoflurane vaporizer |
| Vortex Mixer | VWR | 10153-838 | analog vortex mixer |
Referências
- Dalghi, M. G., Montalbetti, N., Carattino, M. D., Apodaca, G. The Urothelium: Life in a liquid environment. Physiological Reviews. 100 (4), 1621-1705 (2020).
- Truschel, S. T., et al. Stretch-regulated exocytosis/endocytosis in bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 13 (3), 830-846 (2002).
- Lewis, S. A., de Moura, J. L. C. Incorporation of cytoplasmic vesicles into apical membrane of mammalian urinary bladder epthelium. Nature (London). 297 (5868), 685-688 (1982).
- Eaton, A. F., et al. Expansion and contraction of the umbrella cell apical junctional ring in response to bladder filling and voiding. Molecular Biology of the Cell. 30 (16), 2037-2052 (2019).
- Yu, W., Khandelwal, P., Apodaca, G. Distinct apical and basolateral membrane requirements for stretch-induced membrane traffic at the apical surface of bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 20 (1), 282-295 (2009).
- Birder, L., Andersson, K. E. Urothelial signaling. Physiological Reviews. 93 (2), 653-680 (2013).
- Birder, L. A. Urinary bladder, cystitis and nerve/urothelial interactions. Autonomic Neuroscience. 182, 89-94 (2014).
- Apodaca, G., Balestreire, E., Birder, L. A. The uroepithelial-associated sensory web. Kidney International. 72 (9), 1057-1064 (2007).
- Dalghi, M. G., et al. Functional roles for PIEZO1 and PIEZO2 in urothelial mechanotransduction and lower urinary tract interoception. Journal of Clinical Investigation Insight. 6 (19), 152984 (2021).
- Montalbetti, N., et al. Increased urothelial paracellular transport promotes cystitis. American Journal of Physiology: Renal Physiology. 309 (12), 1070-1081 (2015).
- Keay, S. K., Birder, L. A., Chai, T. C. Evidence for bladder urothelial pathophysiology in functional bladder disorders. BioMed Research International. 2014, 865463 (2014).
- Friedel, R. H., Wurst, W., Wefers, B., Kuhn, R. Generating conditional knockout mice. Methods in Molecular Biology. 693, 205-231 (2011).
- Kashyap, M., et al. Down-regulation of nerve growth factor expression in the bladder by antisense oligonucleotides as new treatment for overactive bladder. Journal of Urology. 190 (2), 757-764 (2013).
- Bolenz, C., et al. Cellular uptake and ex vivo urothelial penetration by oligodeoxynucleotides for optimizing treatment of transitional cell carcinoma. Analytical and Quantitative Cytology and Histology. 30 (5), 265-273 (2008).
- Tyagi, P., et al. Intravesical antisense therapy for cystitis using TAT-peptide nucleic acid conjugates. Molecular Pharmaceutics. 3 (4), 398-406 (2006).
- Sadoff, J., et al. Interim results of a phase 1-2a trial of Ad26.COV2.S Covid-19 vaccine. New England Journal of Medicine. 384 (19), 1824-1835 (2021).
- Lee, C. S., et al. Adenovirus-mediated gene delivery: Potential applications for gene and cell-Based therapies in the new era of personalized medicine. Genes & Diseases. 4 (2), 43-63 (2017).
- Ramesh, N., et al. Identification of pretreatment agents to enhance adenovirus infection of bladder epithelium. Molecular Therapy. 10 (4), 697-705 (2004).
- Khandelwal, P., et al. Rab11a-dependent exocytosis of discoidal/fusiform vesicles in bladder umbrella cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (41), 15773-15778 (2008).
- Khandelwal, P., Ruiz, W. G., Apodaca, G. Compensatory endocytosis in bladder umbrella cells occurs through an integrin-regulated and RhoA- and dynamin-dependent pathway. The European Molecular Biology Organization journal. 29 (12), 1961-1975 (2010).
- Khandelwal, P., et al. A Rab11a-Rab8a-Myo5B network promotes stretch-regulated exocytosis in bladder umbrella cells. Molecular Biology of the Cell. 24 (7), 1007-1019 (2013).
- Prakasam, H. S., et al. A1 adenosine receptor-stimulated exocytosis in bladder umbrella cells requires phosphorylation of ADAM17 Ser811 and EGF receptor transactivation. Molecular Biology of the Cell. 25 (24), 3798-3812 (2014).
- Gallo, L. I., et al. RAB27B requirement for stretch-induced exocytosis in bladder umbrella cells. American Journal of Physiology Cell Physiology. 314 (3), 349-365 (2018).
- Amasheh, S., et al. Claudin-2 expression induces cation-selective channels in tight junctions of epithelial cells. Journal of Cell Science. 115, 4969-4976 (2002).
- Yu, A. S., et al. Molecular basis for cation selectivity in claudin-2-based paracellular pores: identification of an electrostatic interaction site. The Journal of General Physiology. 133 (1), 111-127 (2009).
- Kasahara, H., Aoki, H. Gene silencing using adenoviral RNAi vector in vascular smooth muscle cells and cardiomyocytes. Methods in Molecular Medicine. 112, 155-172 (2005).
- Bolognesi, B., Lehner, B. Reaching the limit. eLife. 7, 39804 (2018).
- Atasheva, S., Shayakhmetov, D. M. Cytokine responses to adenovirus and adenovirus vectors. Viruses. 14 (5), 888 (2022).
- Sanchez Freire, V., et al. MicroRNAs may mediate the down-regulation of neurokinin-1 receptor in chronic bladder pain syndrome. American Journal of Pathology. 176 (1), 288-303 (2010).
