Expression von Transgenen im nativen Blasenurothel mittels Adenovirus-vermittelter Transduktion
Summary
Es werden Methoden zur Erzeugung großer Mengen rekombinanter Adenoviren beschrieben, die dann zur Transduktion des nativen Nagetier-Urothels verwendet werden können, was die Expression von Transgenen oder die Herunterregulierung endogener Genprodukte ermöglicht.
Abstract
Es wird angenommen, dass das Urothel, das das Nierenbecken, die Harnleiter, die Blase und die proximale Harnröhre auskleidet, nicht nur eine hochresistente Barriere bildet und Informationen über seine Umgebung an das darunter liegende Gewebe überträgt, wodurch die Entleerungsfunktion und das Verhalten gefördert werden. Eine Störung der Urothelbarriere oder ihrer sensorischen/Schallkopffunktion kann zu Erkrankungen führen. Die Untersuchung dieser komplexen Ereignisse wird durch das Fehlen einfacher Strategien zur Veränderung der Gen- und Proteinexpression im Urothel behindert. Hier werden Methoden beschrieben, die es den Forschern ermöglichen, große Mengen an Adenoviren mit hohem Titer zu erzeugen, die dann verwendet werden können, um Nagetier-Urothel mit hoher Effizienz und auf relativ einfache Weise zu transduzieren. Sowohl cDNAs als auch kleine interferierende RNAs können mittels adenoviraler Transduktion exprimiert werden, und der Einfluss der Transgenexpression auf die Urothelfunktion kann 12 h bis mehrere Tage später beurteilt werden. Diese Methoden haben eine breite Anwendbarkeit auf Studien der normalen und abnormalen Urothelbiologie unter Verwendung von Maus- oder Rattentiermodellen.
Introduction
Das Urothel ist das spezialisierte Epithel, das das Nierenbecken, die Harnleiter, die Blase und die proximale Harnröhreauskleidet 1. Es besteht aus drei Schichten: einer Schicht hochdifferenzierter und polarisierter, oft zweikerniger Schirmzellen, deren apikale Oberflächen in Urin gebadet sind; eine intermediäre Zellschicht mit einer Population von zweikernigen transitamplifizierenden Zellen, die als Reaktion auf ihren akuten Verlust zu oberflächlichen Regenschirmzellen führen können; und eine einzelne Schicht von Basalzellen, von denen eine Teilmenge als Stammzellen fungiert, die das gesamte Urothel als Reaktion auf chronische Verletzungen regenerieren können. Regenschirmzellen sind hauptsächlich für die Bildung der hochresistenten Urothelbarriere verantwortlich, zu deren Bestandteilen eine apikale Membran (reich an Cholesterin und Cerebrosiden) mit geringer Durchlässigkeit für Wasser und gelöste Stoffe sowie ein hochresistenter apikaler Verbindungskomplex (bestehend aus Tight Junctions, Adherens Junctions, Desmosomen und einem zugehörigen Actomyosin-Ring) gehören1 . Sowohl die apikale Oberfläche der Regenschirmzelle als auch ihr Verbindungsring dehnen sich während der Blasenfüllung aus und kehren nach dem Entleeren von 1,2,3,4,5 schnell in ihren vorgefüllten Zustand zurück. Zusätzlich zu seiner Rolle in der Barrierefunktion wird angenommen, dass das Urothel auch sensorische und Wandlerfunktionen hat, die es ihm ermöglichen, Veränderungen im extrazellulären Milieu (z. B. Dehnung) zu erfassen und diese Informationen über die Freisetzung von Mediatoren (einschließlich ATP, Adenosin und Acetylcholin) an darunter liegende Gewebe zu übertragen, einschließlich suburothelialer afferenter Nervenprozesse 6,7,8 . Neuere Beweise für diese Rolle finden sich bei Mäusen, denen die urotheliale Expression von Piezo1 und Piezo2 fehlt, was zu einer veränderten Hohlraumfunktionführt 9. Darüber hinaus entwickeln Ratten, die das porenbildende Protein CLDN2 in der Regenschirmzellschicht überexprimieren, Entzündungen und Schmerzen, die denen bei Patienten mit interstitieller Zystitis entsprechen10. Es wird die Hypothese aufgestellt, dass eine Störung der urothelialen Sensorik/Transducer- oder Barrierefunktion zu mehreren Blasenstörungen beitragen kann 6,11.
Ein besseres Verständnis der Biologie des Urothels in normalen und Krankheitszuständen hängt von der Verfügbarkeit von Werkzeugen ab, die es den Forschern ermöglichen, die endogene Genexpression leicht herunterzuregulieren oder die Expression von Transgenen im nativen Gewebe zu ermöglichen. Während ein Ansatz zur Herunterregulierung der Genexpression darin besteht, bedingte Urothel-Knockout-Mäuse zu erzeugen, hängt dieser Ansatz von der Verfügbarkeit von Mäusen mit floxierten Allelen ab, ist arbeitsintensiv und kann Monate bis Jahre dauern, bis er abgeschlossen ist12. Es überrascht daher nicht, dass Forscher Techniken entwickelt haben, um das Urothel zu transfizieren oder zu transduzieren, was zu Ergebnissen auf einer kürzeren Zeitskala führen kann. Veröffentlichte Methoden zur Transfektion umfassen die Verwendung von kationischen Lipiden13, Antisense-phosphorothioierten Oligodesoxynukleotiden14 oder Antisense-Nukleinsäuren, die an das HIV-TAT-Protein gebunden sind, das das 11-mer-Peptid15 durchdringt. Der Schwerpunkt dieses Protokolls liegt jedoch auf der Verwendung der adenoviral-vermittelten Transduktion, einer gut untersuchten Methodik, die bei der Genabgabe an ein breites Spektrum von Zellen effizient ist, in zahlreichen klinischen Studien getestet wurde und zuletzt verwendet wurde, um die cDNA, die für das COVID-19-Kapsidprotein kodiert, an Empfänger einer Variante des COVID-19-Impfstoffs zu liefern16, 17. Sonstiges Für eine ausführlichere Beschreibung des Lebenszyklus des Adenovirus, der adenoviralen Vektoren und der klinischen Anwendungen von Adenoviren wird der Leser auf Referenz17 verwiesen.
Ein wichtiger Meilenstein bei der Verwendung von Adenoviren zur Transduktion des Urothels war ein Bericht von Ramesh et al., der zeigte, dass kurze Vorbehandlungen mit Detergenzien, einschließlich N-Dodecyl-β-D-Maltosid (DDM), die die Transduktion des Urothels durch ein Adenovirus, das für β-Galactosidase18 kodiert, dramatisch verbesserten. Unter Verwendung dieser Proof-of-Principle-Studie wurde nun die adenoviral vermittelte Transduktion des Urothels verwendet, um eine Vielzahl von Proteinen zu exprimieren, darunter GTPasen der Rab-Familie, Guanin-Nukleotid-Austauschfaktoren, Myosin-Motorfragmente, porenbildende Tight-Junction-assoziierte Claudine und ADAM17 10,19,20,21,22 . Derselbe Ansatz wurde angepasst, um kleine interferierende RNAs (siRNA) zu exprimieren, deren Effekte durch die Co-Expression von siRNA-resistenten Varianten des Transgens22 gerettet wurden. Das hier beschriebene Protokoll umfasst allgemeine Methoden zur Erzeugung großer Mengen hochkonzentrierter Adenoviren, eine Voraussetzung für diese Techniken, sowie Anpassungen der Methoden von Ramesh et al.18, um Transgene im Urothel mit hoher Effizienz zu exprimieren.
Protocol
Representative Results
Discussion
Während sich Ramesh et al. auf die Entwicklung von Strategien zur Verwendung der adenoviralen Transduktion bei der Behandlung von Blasenkrebs konzentrierten 18, haben neuere Berichte den Nutzen dieser Techniken bei der Untersuchung der normalen Urothelbiologie/-physiologie und Pathophysiologie gezeigt 10,18,19,20,21 . Zu den wichtigen …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde durch einen Pilotprojektpreis durch P30DK079307 (an M.G.D.), NIH-Zuschuss R01DK119183 (an G.A. und M.D.C.), NIH-Zuschuss R01DK129473 (an G.A.), einen Karriereentwicklungspreis der American Urology Association und einen Zuschuss der Winters Foundation (an N.M.), durch das Cell Physiology and Model Organisms Kidney Imaging Cores des Pittsburgh Center for Kidney Research (P30DK079307) unterstützt. und von S10OD028596 (an G.A.), die den Kauf des konfokalen Systems finanzierte, mit dem einige der in diesem Manuskript präsentierten Bilder aufgenommen wurden.
Materials
| 10 mL pipette | Corning Costar (Millipore Sigma) | CLS4488 | sterile, serological pipette, individually wrapped |
| 12 mL ultracentrifuge tube | ThermoFisher | 06-752 | PET thinwall ultracentrifuge tube |
| 15 mL conical centrifuge tube | Falcon (Corning) | 352097 | sterile |
| 18 G needle | BD | 305196 | 18 G x 1.5 in needle |
| 20 mL pipette | Corning Costar (Millipore Sigma) | CLS4489 | sterile, serological pipette, individually wrapped |
| 50 mL conical centrifuge tube | Falcon (Corning) | 352098 | sterile |
| 5 mL pipette | Corning Costar (Millipore Sigma) | CLS4487 | sterile, serological pipette, individually wrapped |
| Cavicide | Henry Schein | 6400012 | Anti-viral solution |
| Cell culture dish – 15 cm | Falcon (Corning) | 353025 | sterile, tissue-culture treated (150 mm x 25 mm dish) |
| Cell scraper | Sarstedt | 893.1832 | handle length 24 cm, blade length 1.7 cm |
| CsCl | Millipore Sigma | C-4306 | Molecular Biology grade ≥ 98% |
| DMEM culture medium (high glucose) | Gibco (ThermoFisher) | 11965092 | with 4.5 g/L glucose + L-glutamine + phenol red |
| EDTA | Millipore Sigma | EDS | Bioiultra grade ≥ 99% |
| Fetal bovine serum | Hyclone (Cytiva) | SH30070.03 | defined serum |
| Glass pipette | Fisher Scientific | 13-678-20A | 5.75 in glass pipette, autoclaved |
| Glycerol | Millipore Sigma | G-5516 | Molecular Biology grade ≥ 99% |
| HEK293 cells | ATCC | CRL-3216 | HEK293T cells are a variant of HEK293 cells that express the SV40 large T-antigen |
| Isoflurane | Covetrus | 29405 | |
| IV catheter – mouse | Smith Medical Jelco | 3063 | 24 G x 3/4 in Safety IV catheter radiopaque |
| IV catheter – rat | Smith Medical Jelco | 3060 | 22 G x 1 in Safety IV catheter radiopaque |
| KCl | Millipore Sigma | P-9541 | Molecular Biology grade ≥ 99% |
| KH2PO4 | Millipore Sigma | P5655 | Cell culture grade ≥ 99% |
| Na2HPO4•7 H2O | Millipore Sigma | 431478 | ≥ 99.99% |
| NaCl | Millipore Sigma | S3014 | Molecular Biology grade ≥ 99% |
| N-dodecyl-β-D-maltoside | Millipore Sigma | D4641 | ≥ 98% |
| Nose cone for multiple animals | custom designed | commercial options include one from Parkland Scientific (RES3200) | |
| PD-10 column | GE Healthcare | 17-085-01 | Prepacked columns filled ith Sephadex G-25M |
| Penicillin/streptomycin antibiotic (100x) | Gibco (ThermoFisher) | 15070063 | 100x concentrated solution |
| Spectrophotometer | Eppendorf | BioPhotometer | |
| Stand and clamp | Fisher Scientific | 14-679Q and 05-769-8FQ | available from numerous suppliers |
| Sterile filter unit | Fisher Scientific (Nalgene) | 09-740-65B | 0.2 µm rapid-flow filter unit (150 mL) |
| Sterile filter unit 0.2 µm (syringe) | Fisher Scientific | SLGV004SL | Millipore Sigma Milex 0.22 µm filter unit that attaches to syringe |
| Super speed centrifuge | Eppendorf | 5810R | with Eppendorf F34-6-38 fixed angle rotor (12,000 rpm) |
| Syringe (1 mL) | BD | 309628 | 1-mL syringe Luer-lok tip – sterile |
| Syringe (3 mL) | BD | 309656 | 3-mL syringe slip tip – sterile |
| Table-top centrifuge (low speed) | Eppendorf | 5702 | with swinging bucket rotor |
| Transfer pipettes | Fisher Scientific | 13-711-9AM | polyethylene 3.4 mL transfer pipette |
| Tris-base | Millipore Sigma | 648310-M | Molecular Biology grade |
| TrypLE select protease solution | Gibco (ThermoFisher) | 12604013 | TrypLE express enzyme (1x), no phenol red |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima L-80 XP | with Beckman SW41 rotor (41,000 rpm) |
| Vaporizer | General Anesthetic Services, Inc. | Tec 3 | Isoflurane vaporizer |
| Vortex Mixer | VWR | 10153-838 | analog vortex mixer |
Referências
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