वर्तमान प्रोटोकॉल दिखाता है कि 3 डी और 2 डी कल्चर स्थितियों दोनों के तहत मानव विस्तारित संभावित स्टेम कोशिकाओं (एचईपीएससी) से हल्के साइटोटॉक्सिसिटी के साथ सीडी 3−/सीडी 45 + सीडी 56 + कोशिकाओं को कैसे अलग किया जाए। यह जटिल माइक्रोएन्वायरमेंट के विनाश के बिना नियमित फेनोटाइपिक सत्यापन की अनुमति देता है।
मानव प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से प्राकृतिक हत्यारा (एनके) कोशिकाओं का भेदभाव इम्यूनोथेरेपी के लिए नैदानिक ग्रेड सेलुलर उत्पादों पर अनुसंधान और निर्माण की अनुमति देता है। यहां वर्णित एक दो-चरण प्रोटोकॉल है जो सीरम-मुक्त वाणिज्यिक माध्यम और साइटोकिन्स (इंटरल्यूकिन [आईएल]-3, आईएल -7, आईएल -15, स्टेम सेल फैक्टर [एससीएफ], और एफएमएस जैसे टायरोसिन किनेज 3 लिगैंड [एफटीएल 3 एल]) के कॉकटेल का उपयोग करता है ताकि मानव विस्तारित संभावित स्टेम कोशिकाओं (एचईपीएससी) को उन कोशिकाओं में अलग किया जा सके जिनके पास 3-आयामी (3 डी) और 2-आयामी (2 डी) संस्कृति तकनीक दोनों के साथ इन विट्रो में एनके सेल गुण होते हैं। इस प्रोटोकॉल का पालन करते हुए, CD3−CD56+ या CD45+CD56+ NK कोशिकाएँ लगातार उत्पन्न होती हैं. जब 3 घंटे के लिए ट्यूमर लक्ष्यों के साथ सह-संवर्धन किया जाता है, तो विभेदित उत्पाद आईएल -2-स्वतंत्र स्थायी सेल लाइन, एनके 92 एमी कोशिकाओं की तुलना में हल्के साइटोटॉक्सिसिटी प्रदर्शित करते हैं। प्रोटोकॉल 3 डी संरचनाओं की पीढ़ी द्वारा भेदभाव माइक्रोएन्वायरमेंट की जटिलता को संरक्षित करता है, इस प्रकार प्रतिरक्षा कोशिकाओं और उनके आला के बीच स्थानिक संबंधों के अध्ययन की सुविधा प्रदान करता है। इस बीच, 2 डी संस्कृति प्रणाली नाजुक भेदभाव आला को नुकसान पहुंचाए बिना सेल भेदभाव के नियमित फेनोटाइपिक सत्यापन को सक्षम बनाती है।
मानव भ्रूण स्टेम सेल (एचईएससी) और मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचपीएससी) जैसे पारंपरिक प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल की तुलना में, मानव विस्तारित संभावित स्टेम सेल (एचईपीएससी) टोटिपोटेंसी की स्थिति के करीब हैं, क्योंकि वे अतिरिक्त भ्रूण और भ्रूण वंश दोनों में अंतर करसकते हैं। उदाहरण के लिए, एचईपीएससी को ट्रोफोब्लास्ट1 और जर्दी-थैली जैसी कोशिकाओं2 में विभेदित किया जा सकता है। एचईपीएससी की अनूठी शक्ति प्राप्त करने के लिए, एक व्यक्तिगत ब्लास्टोमेरे को एक माध्यम में सुसंस्कृत किया जाता है जिसमें कई छोटे अणु होते हैं जो वंश प्रतिबद्धता सिग्नलिंग1 को रोकते हैं, जिसे ईपीएससी माध्यम (ईपीएससीएम) कहा जाता है। ईपीएससीएम में एचईएससी और एचआईपीएससी की खेती उन्हें ट्रोफोब्लास्टकोशिकाओं में अलग करने के लिए उनकी पहले से प्रतिबंधित शक्ति का विस्तार करती है।
प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल नए आनुवंशिक संशोधनों के साथ प्रयोग करने के लिए एक मूल्यवान अनुसंधान उपकरण हैं। प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं की आत्म-नवीकरण और विभेदन क्षमताओं के कारण, एक प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल का एक रूपांतरित क्लोन विभेदित सेलुलर उत्पादों का उत्पादन कर सकता है जिनके पास एक ही स्थान पर समान आनुवंशिक संशोधन होता है। झू और कॉफमैन ने पारंपरिक प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचईएससी और एचआईपीएससी) से एनके सेल भेदभाव के लिए मानक स्थापित किया। सबसे पहले, उन्होंने प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त भ्रूण शरीर से हेमटोपोइएटिक स्टेम कोशिकाओं (एचएससी) को प्रेरित किया। स्टेम सेल फैक्टर (एससीएफ), एफएमएस जैसे टायरोसिन किनेज 3 लिगैंड (एफटीएल 3 एल), इंटरल्यूकिन (आईएल) -7, आईएल -15, और आईएल -3 के शुरुआती पूरक के अलावा एचएससी को प्राकृतिक हत्यारा (एनके) कोशिकाओं में विकसित करने के लिए पक्षपाती बनाया गया। इसके बाद, उन्होंने कृत्रिम एंटीजन-प्रेजेंटिंग कोशिकाओं (एएपीसी) के साथ एनके कोशिकाओं का विस्तार किया, जो आईएल -2 के निरंतर पूरक के साथ झिल्ली-बाध्य आईएल -21 पेश करते हैं। शोधकर्ताओं ने चिमेरिक एंटीजन रिसेप्टर (सीएआर-आईएनके) 4 के साथ संपन्न आईपीएससी-व्युत्पन्न प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए इम्यूनोथेरेपी के लिए इस दृष्टिकोण को लागू किया है।
मानव एनके कोशिकाओं को परिधीय रक्त में सीडी 3-सीडी 56 + ल्यूकोसाइट्स के रूप में परिभाषित किया गया है। वे वायरस से संक्रमित कोशिकाओं और ट्यूमर कोशिकाओंके खिलाफ प्रभावक हैं। एनके कोशिकाओं पर कुछ निरोधात्मक रिसेप्टर्स सामान्य कोशिकाओं में सर्वव्यापी रूप से व्यक्त अणुओं को पहचानते हैं। एक उदाहरण के रूप में, एनके कोशिकाओं पर व्यक्त एनकेजी 2 ए / सीडी 94 हेटेरोडिमर एमएचसी वर्ग 1 अणुओं5 को पहचानता है। इस बीच, एनके कोशिकाओं पर सक्रिय रिसेप्टर्स तनाव-प्रेरित लिगेंड को पहचानते हैं, जैसे कि एनकेजी 2 डी परिवर्तन-प्रेरित एमएचसी वर्ग 1 पॉलीपेप्टाइड-संबंधित अनुक्रम ए (एमआईसीए / एमआईसीबी) 6 को कैसे पहचानता है। कुछ रूपांतरित कोशिकाएं प्रतिरक्षा निगरानी से बचने के लिए अपने “स्व-लिगेंड” को डाउनरेगुलेट करती हैं और असामान्य लिगेंड को बढ़ाती हैं, जो एनके कोशिकाओं को अपनी लिटिक मशीनरी को निष्पादित करने के लिए ट्रिगर करती हैं। एनके कोशिकाओं की आंतरिक एंटी-ट्यूमर क्षमताओं ने इस प्रतिरक्षा कोशिका प्रकार पर ध्यान दिया है।
भ्रूण और अतिरिक्त-भ्रूण वंश दोनों को एक साथ जन्म देने की क्षमता एचईपीएससी को पारंपरिक प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं की तुलना में भ्रूण के विकास आला का अधिक वफादार पुनर्मूल्यांकन प्रदान कर सकती है। अनुभव से, एचपीएससी की तुलना में एचईपीएससी की शक्ति को बनाए रखना आसान है। वर्तमान अध्ययन में, हेमटोपोइएटिक वंश में विकसित करने के लिए एचईपीएससी को पूर्वाग्रह करने के लिए एक प्रोटोकॉल (चित्रा 1) विकसित किया गया था और बाद में पूर्वज कोशिकाओं को प्राकृतिक हत्यारा (एनके) कोशिकाओं में अलग किया गया था। प्रोटोकॉल में, सीरम विसंगतियों से बचने के लिए वाणिज्यिक मीडिया का उपयोग किया जाता है, इसके बाद लिम्फोइड वंश में पूर्वाग्रह भेदभाव के लिए साइटोकिन्स के चरणबद्ध जोड़ होते हैं। इस प्रोटोकॉल में सीडी 3-सीडी 56 +/सीडी 45 + सीडी 56 + सीडी 56 + कोशिकाओं को प्राप्त करते हुए जटिल 3 डी माइक्रोएन्वायरमेंट को संरक्षित करने के लिए दो प्रणालियां हैं जो फेनोटाइपिक और कार्यात्मक रूप से मानव एनके कोशिकाओं से मिलती जुलती हैं।
यह प्रोटोकॉल प्रतिरक्षा कोशिकाओं की उनके भेदभाव आला के साथ बातचीत का अध्ययन करने में उपयोगी हो सकता है और इम्यूनोथेराप्यूटिक उपयोगों के लिए सेलुलर उत्पादों को शुद्ध करने की क्षमता हो सकती है।
एचईपीएससी से सीडी 45 + सीडी 56 + कोशिकाओं के सफल भेदभाव को सुनिश्चित करने के लिए कुछ महत्वपूर्ण कदम हैं। पूर्व-विभेदन (चरण 1.2) महत्वपूर्ण है क्योंकि ईपीएससी माध्यम में वंश प्रतिबद्धता1 के अवरोधक होते हैं। पूर्व-विभेदन के बाद, एचईपीएससी की गुंबद के आकार की कॉलोनियों को चपटा कर दिया जाता है (चित्रा 2 बी)। एचईपीएससी (चरण 1.3) से ईबी के गठन के दौरान वाई 27632, एक रो-काइनेज अवरोधक (आरओसीकेआई) को जोड़ना पृथक्करण के बाद एचईपीएससी के अस्तित्व के लिए अपरिहार्य है। एक अन्य महत्वपूर्ण विचार प्रत्येक ट्रांसवेल पर लगाए गए ईबी की संख्या है। चूंकि यह एक छोटे पैमाने पर प्रणाली है, इसलिए मीडिया के अतिउपभोग को रोकने के लिए प्रति ट्रांसवेल दो से तीन ईबी इष्टतम घनत्व है। 3 डी प्रणाली के लिए एनके सेल भेदभाव के पूरे पाठ्यक्रम के दौरान वायु-तरल इंटरफ़ेस बनाए रखा जाता है, जिसे स्ट्रोमल कोशिकाओं की ध्रुवीयता को बनाए रखने और एजीएम-व्युत्पन्न हेमटोपोइएटिक पूर्वजों14,15 के विस्तार का समर्थन करने के लिए माना जाता है।
जैसा कि पहले उल्लेख किया गया है, ट्रांसवेल पर ईबी का घनत्व सफल भेदभाव के लिए एक निर्धारण कारक है। इसके लिए महत्वपूर्ण संकेत ट्रांसवेल पर ईबी के आरोपण के 1 दिन बाद माध्यम का रंग है। यदि रंग जल्दी से पीला हो जाता है, तो यह या तो संदूषण या भीड़भाड़ को इंगित करता है। समस्या को हल करने के लिए, अतिरिक्त ईबी को मैन्युअल रूप से लेने और उन्हें दूसरे ट्रांसवेल में स्थानांतरित करने के लिए 1 एमएल पिपेट का उपयोग किया जाना चाहिए।
इस प्रोटोकॉल की एक प्रमुख सीमा आईवीडी उत्पादों में सीडी 3−/सीडी 45 + सीडी 56 + कोशिकाओं की शुद्धता है, जिसे शुद्ध एनके 92 एमी कोशिकाओं की तुलना में अवर साइटोटॉक्सिसिटी के लिए आंशिक रूप से जिम्मेदार माना जाता है। एक 3 डी संस्कृति प्रणाली को एक ईबी की पीढ़ी के माध्यम से हेमटोपोइएटिक पूर्वजों को प्रेरित करने के लिए नियोजित किया गया था जो तीन भ्रूण रोगाणु परतों जैसा दिखता है। यह रणनीति अस्थि मज्जा माइक्रोएन्वायरमेंट में रक्त कोशिकाओं के विकास की नकल करती है, इस प्रकार भेदभाव 3 का समर्थन करने के लिए स्ट्रोमल कोशिकाओं की आवश्यकता को दूर करतीहै। हेमटोपोइएटिक पूर्वजों को शुद्ध करने के लिए एक छंटाई कदम के बिना, आईवीडी उत्पादों की शुद्धता कम होने की उम्मीद है। समापन बिंदु उत्पाद की शुद्धता को बढ़ाते हुए जटिल भेदभाव आला को बनाए रखने की एक रणनीति क्रमबद्ध सीडी 3-सीडी 56 + आईवीडी उत्पादों के लिए एक विस्तार विधि विकसित कर रही है। उदाहरण के लिए, क्रमबद्ध CD3-CD56+ IVD उत्पादों को कृत्रिम एंटीजन-प्रेजेंटिंग कोशिकाओं (AAPCs) पर संवर्धित किया जा सकता है, जैसे कि झिल्ली-बाध्य IL-21 के साथ इंजीनियर किए गए विकिरणित K562 कोशिकाएं। संस्कृति में आईएल -2 की आपूर्ति के साथ, यह विधि एनके सेल नंबर 3 में 1,000 गुना वृद्धि प्राप्त कर सकतीहै।
एक और सीमा सकारात्मक संदर्भ के रूप में वास्तविक मानव एनके कोशिकाओं तक सीमित पहुंच है। एनके 92एमआई कोकल्चर परख में नियोजित सकारात्मक संदर्भ है, लेकिन यह पर्याप्त सटीक नहीं है। एनके 92एमआई कोशिकाओं को एनके 92 कोशिकाओं से इंजीनियर किया जाता है, एक स्थायी सेल लाइन जो सक्रिय एनके सेल फेनोटाइप16 को व्यक्त करती है, ताकि संस्कृति आवश्यकताओं को पूरा करने के लिए स्वायत्त रूप से आईएल -2 का उत्पादन किया जा सके। एनके 92 कोशिकाएं मानव प्राथमिक एनके कोशिकाओं की तुलना में विट्रो में के 562 कोशिकाओं के खिलाफ बेहतर हत्या गतिविधि का प्रदर्शन करतीहैं। समानांतर में परिधीय रक्त एनके कोशिकाओं की साइटोटॉक्सिसिटी का विश्लेषण करके आईवीडी उत्पादों की ट्यूमर-हत्या क्षमता की एक निष्पक्ष तुलना प्राप्त की जा सकती है, लेकिन दुर्भाग्य से, रक्त बैंकों तक पहुंच की कमी है।
इस दो-सिस्टम संस्कृति प्रोटोकॉल का उद्देश्य एचईपीएससी से सीडी 3−/सीडी 45 + सीडी 56 + कोशिकाओं को उत्पन्न करना है। एफएसीएस के साथ सतह मार्करों और साइटोटॉक्सिसिटी का आकलन नियमित रूप से भेदभाव आला को बाधित किए बिना 2 डी सिस्टम से कोशिकाओं पर किया जा सकता है। सीडी 3-सीडी 56 + कोशिकाओं के प्रतिशत में अंतर के बावजूद, 3 डी और 2 डी सिस्टम सीडी 56 अभिव्यक्ति (चित्रा 3) में समान भिन्नताओं के साथ सीडी 3-सीडी 56 + कोशिकाओं को प्राप्त कर सकते हैं, और 2 डी प्रणाली 3 डी संस्कृति स्थिति से लिम्फोइड पूर्वजों के अस्तित्व को दर्शाती है।
3 डी संस्कृति प्रणाली का उपयोग करने का महत्व यह है कि यह जटिल भेदभाव आला के भीतर स्थानिक संबंधों और सेल-सेल इंटरैक्शन पर शोध करने के लिए स्थानिक ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स या इमेजिंग मास स्पेक्ट्रोमेट्री जैसे उच्च-रिज़ॉल्यूशन प्रोफाइलिंग परख के उपयोग की अनुमति देता है।
The authors have nothing to disclose.
हम डॉ हांडी काओ, सैंक्सिंग गाओ, डेविड जियांग, यिमिंग चाओ, रितिका जोगानी, ओवेन चान, स्टेफ़नी चेउंग और सेलिन चैन को उनकी तकनीकी सहायता और उपयोगी चर्चाओं के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को प्लेटफॉर्म टेक्नोलॉजी फंड द्वारा समर्थित किया गया था। चित्र 1 BioRender.com के साथ बनाया गया है।
30 w/v% Albumin Solution, from Bovine Serum(BSA), Fatty Acid Free | Wako Chemicals | 017-22231 | For resuspending cytokines. |
ACCUMAX | STEMCELL Technologies | 07921 | |
Anti-human-CD159a-PE | BD | 375104 | During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 5% FBS) |
Anti-human-CD3-APC antibodies | BD | 555355 | During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 2% FBS) |
Anti-human-CD45-APC antibodies | BD | 555485 | During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 3% FBS) |
Anti-human-CD56-PE antibodies | BD | 555516 | During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 4% FBS) |
Anti-human-CD56-PEcy7 antibodies | BD | 335826 | During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 5% FBS) |
Anti-human-CD94-APC | BD | 559876 | During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 5% FBS) |
Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film | Thermo Scientific | 11772644 | |
Cd244 Monoclonal Antibody (eBioC1.7 (C1.7)), Functional Grade, eBioscience | Thermo Scientific | 16-5838-85 | |
Costar 6.5 mm Transwell, 0.4 µm Pore Polyester Membrane Inserts | STEMCELL Technologies | 3470 | |
Dapi Solution, 1 mg/mL | BD | 564907 | It is resuspended with ddH2O so the concentration is 10 µM/mL. Add 1 µL of the aliquot in 300 µL of FACS buffer (PBS + 2% FBS) |
DMEM | CPOS-Bioreagent core | 11965092 | |
DMEM/F12 | Thermo Scientific | 11320033 | |
FcX, human | Biolengend | 422302 | |
Fetal Bovine Serum(FBS) qualified E.U.-approved South America | CPOS-Bioreagent core | 10270106 | |
FlowJo v10.8.0 | BD | ||
Gibco PBS (10x) pH 7.4 | CPOS-Bioreagent core | 70011044 | 10x concentrated PBS is manufactured as follows: without calcium, magnesium or phenol red |
K562 cells | ATCC | CCL-243 | |
Knockout Serum Replacement | Thermo Scientific | 10828-028 | |
MyeloCult H5100 medium | STEMCELL Technologies | 5150 | |
NK92mi cells | ATCC | CRL-2408 | Lot: 70045208. Once thawed, they are cultured in MyeloCult H5100 medium, and maintained the density between 2 x 105 to 1 x 106 cell/mL. |
Nunc Cell-Culture Treated Multidishes 12 well plate | Thermo Scientific | 150628 | flat bottom |
Nunc Cell-Culture Treated Multidishes 24 well plate | Thermo Scientific | 142475 | |
Nunc EasYDish Dishes | Thermo Scientific | 150460 | |
pLenti-GFP Lentiviral Control Vector | CELL BIOLABS | LTV-400 | It is packaged as the manufactuer suggested (https://www.cellbiolabs.com/sites/default/files/LTV-400-gfp- lentiviral-plasmid.pdf). 40 μL of 50x lentivirus is added with 1 μL 10 mg/mL polybrene per 1 mL of cell suspension. Complete medium change is performed 24 h after the addition of lentivirus. Cells are incubated undisputedly for 3 days at 37 °C, 5% CO2. |
Polybrene | EMD Millipore | TR-1003-G | |
Recombinant Human Flt-3 Ligand/FLT3L Protein | R&D Systems | 308-FK-005 | It is resuspend with PBS + 0.2% BSA. Thr working concentration is 10 ng/mL or 12 IU/mL. |
Recombinant Human IL-15 Protein | R&D Systems | 247-ILB-005 | It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 10 ng/mL or 4500 IU/mL. |
Recombinant Human IL-18/IL-1F4 Protein | R&D Systems | 9124-IL-010 | It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 50 ng/mL. The IU is not provided by the company. |
Recombinant Human IL-2 Protein | R&D Systems | 202-IL-010 | It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 50 ng/mL or 455 IU/mL. |
Recombinant Human IL-3 Protein, 50ug | PeproTech | 200-03 | It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 5 ng/mL or 14 IU/mL. |
Recombinant Human IL-7 Protein | R&D Systems | 207-IL-010 | It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 20 ng/mL or 8800 IU/mL. |
Recombinant Human SCF Protein | R&D Systems | 255-SC-010 | It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 20 ng/mL or 26 IU/mL. |
STEMdiff Hematopoietic Kit | STEMCELL Technologies | 5310 | Medium A: 45 mL STEMdiff Hematopoietic Basal Medium + STEMdiff Hematopoietic Supplement A ; Medium B: 75 STEMdiff Hematopoietic Basal Medium + STEMdiff Hematopoietic Supplement B |
StemSpan lymphoid differentiation coating material | STEMCELL Technologies | 9950 | It is resuspended in PBS (100x) |
StemSpan NK cell differentiation medium | STEMCELL Technologies | 9960 | It is prepared by adding 500 µL StemSpan NK Cell Differentiation Supplement (100x) into 49.5 mL of SFEM II. Both are provided in StemSpan NK Cell Generation Kit. |
StemSpan lymphoid expansion medium | STEMCELL Technologies | 9960 | It is prepared by adding 5 mL StemSpan Lymphoid Progenitor Expansion Supplement (10x) into 45 mL of StemSpan SFEM II. Both are provided in StemSpan NK Cell Generation Kit. |
StemSpan NK Cell Generation Kit | STEMCELL Technologies | 9960 | Thaw the medium and materials in room temperature and the medium is stored in 4 °C once thawed. |
The BD LSRFortessa cell analyzer | BD | ||
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Scientific | 25300054 | |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | working concentration: 10 µM |