Das vorliegende Protokoll zeigt, wie CD3−/CD45+CD56+-Zellen mit leichter Zytotoxizität von humanen Stammzellen mit expandiertem Potenzial (hEPSCs) sowohl unter 3D- als auch unter 2D-Kulturbedingungen unterschieden werden können. Dies ermöglicht eine routinemäßige phänotypische Validierung, ohne die komplexe Mikroumgebung zu zerstören.
Die Differenzierung von natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) von humanen pluripotenten Stammzellen ermöglicht die Erforschung und Herstellung von klinischen Zellprodukten für die Immuntherapie. Hier wird ein Zwei-Phasen-Protokoll beschrieben, das ein serumfreies kommerzielles Medium und einen Cocktail aus Zytokinen (Interleukin [IL]-3, IL-7, IL-15, Stammzellfaktor [SCF] und FMS-ähnlicher Tyrosinkinase-3-Ligand [Ftl3L]) verwendet, um humane Stammzellen mit erweitertem Potenzial (hEPSCs) in Zellen zu differenzieren, die NK-Zelleigenschaften in vitro sowohl mit 3-dimensionaler (3D) als auch mit 2-dimensionaler (2D) Kulturtechnologie besitzen. Nach diesem Protokoll werden konsistent CD3−CD56+ oder CD45+CD56+ NK-Zellen erzeugt. Bei Kokultivierung mit Tumortargets für 3 h zeigen die differenzierten Produkte eine leichte Zytotoxizität im Vergleich zu einer IL-2-unabhängigen permanenten Zelllinie, den NK92mi-Zellen. Das Protokoll bewahrt die Komplexität der Differenzierungsmikroumgebung durch die Generierung von 3D-Strukturen und erleichtert so die Untersuchung der räumlichen Beziehungen zwischen Immunzellen und ihren Nischen. In der Zwischenzeit ermöglicht das 2D-Kultursystem die routinemäßige phänotypische Validierung der Zelldifferenzierung, ohne die empfindliche Differenzierungsnische zu beeinträchtigen.
Im Vergleich zu herkömmlichen pluripotenten Stammzellen wie humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) und humanen induzierten pluripotenten Stammzellen (hiPS-Zellen) sind humane Stammzellen mit erweitertem Potenzial (hEPSCs) näher am Zustand der Totipotenz, da sie sich sowohl in extraembryonale als auch in embryonale Linien differenzieren können1. Zum Beispiel können hEPSCs in Trophoblasten1 und Dottersack-ähnliche Zellen2 unterschieden werden. Um die einzigartige Wirksamkeit von hEPSCs zu erreichen, wird ein einzelnes Blastomer in einem Medium kultiviert, das mehrere kleine Moleküle enthält, die die Lineage-Commitment-Signalübertragung1 hemmen, die als EPSC-Medium (EPSCM) bezeichnet wird. Die Kultivierung von hES-Zellen und hiPS-Zellen im EPSCM erweitert ihre zuvor eingeschränkte Potenz, um sie zu Trophoblastenzellen zu differenzieren1.
Pluripotente Stammzellen sind ein wertvolles Forschungswerkzeug, um mit neuartigen genetischen Veränderungen zu experimentieren. Aufgrund der Selbsterneuerungs- und Differenzierungsfähigkeiten pluripotenter Stammzellen kann ein transformierter Klon einer pluripotenten Stammzelle differenzierte Zellprodukte produzieren, die die gleiche genetische Veränderung am selben Locus besitzen. Zhu und Kaufman etablierten den Standard für die Differenzierung von NK-Zellen aus konventionellen pluripotenten Stammzellen (hES-Zellen und hiPS-Zellen)3. Zunächst induzierten sie hämatopoetische Stammzellen (HSZ) aus einem embryoiden Körper, der aus pluripotenten Stammzellen gewonnen wurde. Die Zugabe von Stammzellfaktor (SCF), FMS-ähnlichem Tyrosinkinase-3-Liganden (Ftl3L), Interleukin (IL)-7, IL-15 und einer frühen Ergänzung von IL-3 verzerrte die HSCs dazu, sich zu natürlichen Killerzellen (NK) zu entwickeln. Anschließend expandierten sie die NK-Zellen mit künstlichen Antigen-präsentierenden Zellen (aAPCs), die membrangebundenes IL-21 präsentieren, mit der kontinuierlichen Supplementierung von IL-2. Forscher haben diesen Ansatz auf die Immuntherapie angewendet, um iPSC-abgeleitete natürliche Killerzellen zu erzeugen, die mit dem chimären Antigenrezeptor (CAR-iNK) ausgestattet sind4.
Humane NK-Zellen sind definiert als CD3−CD56+-Leukozyten im peripheren Blut. Sie sind Effektoren gegen virusinfizierte Zellen und Tumorzellen5. Einige inhibitorische Rezeptoren auf NK-Zellen erkennen Moleküle, die ubiquitär in normalen Zellen exprimiert werden. Zum Beispiel erkennt das NKG2A/CD94-Heterodimer, das auf NK-Zellen exprimiert wird, MHC-Klasse-I-Moleküle5. In der Zwischenzeit erkennen die aktivierenden Rezeptoren auf NK-Zellen stressinduzierte Liganden, wie NKG2D transformationsinduzierte MHC-Klasse-I-Polypeptid-bezogene Sequenz A (MICA/MICB)6 erkennt. Einige transformierte Zellen regulieren ihre “Selbstliganden” herunter, um der Immunüberwachung zu entgehen und aberrante Liganden hochzuregulieren, was die NK-Zellen dazu veranlasst, ihre lytische Maschinerie auszuführen. Die intrinsischen Anti-Tumor-Fähigkeiten von NK-Zellen haben die Aufmerksamkeit auf diesen Immunzelltyp gelenkt.
Die Fähigkeit, gleichzeitig sowohl embryonale als auch extraembryonale Abstammungslinien hervorzubringen, kann dazu führen, dass hEPSCs die Nische der Embryonalentwicklung genauer rekapitulieren als herkömmliche pluripotente Stammzellen. Erfahrungsgemäß ist es einfacher, die Wirksamkeit von hEPSC als von hiPS-Zellen aufrechtzuerhalten. In der vorliegenden Studie wurde ein Protokoll entwickelt (Abbildung 1), um hEPSCs so zu beeinflussen, dass sie sich zu hämatopoetischen Linien entwickeln und später Vorläuferzellen in vitro zu natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) differenzieren. Im Protokoll werden kommerzielle Medien verwendet, um Seruminkonsistenzen zu vermeiden, gefolgt von der schrittweisen Zugabe von Zytokinen, um die Differenzierung in lymphatische Linien zu verzerren. Dieses Protokoll verfügt über zwei Systeme, um die komplexe 3D-Mikroumgebung zu erhalten und gleichzeitig CD3-CD56+/CD45+CD56+-Zellen abzuleiten, die phänotypisch und funktionell menschlichen NK-Zellen ähneln.
Dieses Protokoll kann nützlich sein, um die Interaktion von Immunzellen mit ihren Differenzierungsnischen zu untersuchen und könnte das Potenzial haben, zelluläre Produkte für immuntherapeutische Zwecke zu reinigen.
Es gibt einige entscheidende Schritte, um die erfolgreiche Differenzierung von CD45+CD56+-Zellen von hEPSCs sicherzustellen. Die Vordifferenzierung (Schritt 1.2) ist entscheidend, da das EPSC-Medium Inhibitoren der Abstammungsbindung1 enthält. Nach der Vordifferenzierung werden die kuppelförmigen Kolonien von hEPSCs abgeflacht (Abbildung 2B). Die Zugabe von Y27632, einem Rho-Kinase-Inhibitor (ROCKi), während der Bildung von EBs aus hEPSCs (Schritt 1.3) ist für das Überleben der hEPSCs nach Dissoziation unerlässlich. Eine weitere wichtige Überlegung ist die Anzahl der EBs, die auf jedem Transwell gepflanzt werden. Da es sich um ein kleines System handelt, sind zwei bis drei EBs pro Transwell die optimale Dichte, um einen übermäßigen Verbrauch der Medien zu vermeiden. Die Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche wird während des gesamten Verlaufs der NK-Zelldifferenzierung für das 3D-System aufrechterhalten, von dem angenommen wird, dass es die Polarität der Stromazellen beibehält und die Expansion der AGM-abgeleiteten hämatopoetischen Vorläuferzellen unterstützt14,15.
Wie bereits erwähnt, ist die Dichte der EBs auf dem Transwell ein entscheidender Faktor für eine erfolgreiche Differenzierung. Das Schlüsselzeichen dafür ist die Farbe des Mediums 1 Tag nach der Implantation von EBs auf dem Transwell. Wenn die Farbe schnell gelb wird, deutet dies entweder auf eine Kontamination oder eine Überfüllung hin. Um das Problem zu lösen, sollte eine 1-ml-Pipette verwendet werden, um zusätzliche EBs manuell aufzunehmen und in einen anderen Transwell zu überführen.
Eine wesentliche Einschränkung dieses Protokolls ist die Reinheit der CD3−/CD45+ CD56+ Zellen in den IVD-Produkten, von der angenommen wird, dass sie teilweise für die geringere Zytotoxizität im Vergleich zu reinen NK92mi-Zellen verantwortlich ist. Ein 3D-Kultursystem wurde verwendet, um hämatopoetische Vorläuferzellen durch die Erzeugung eines EB zu induzieren, das den drei embryonalen Keimblättern ähnelt. Diese Strategie ahmt die Entwicklung von Blutzellen in der Mikroumgebung des Knochenmarks nach, wodurch die Notwendigkeit von Stromazellen zur Unterstützung der Differenzierung beseitigtwird 3. Ohne einen Sortierschritt zur Reinigung der hämatopoetischen Vorläuferzellen wird erwartet, dass die Reinheit der IVD-Produkte verringert wird. Eine Strategie, um die komplexe Differenzierungsnische beizubehalten und gleichzeitig die Reinheit des Endpunktprodukts zu erhöhen, ist die Entwicklung einer Expansionsmethode für die sortierten CD3−CD56+ IVD-Produkte. Zum Beispiel können die sortierten CD3−CD56+ IVD-Produkte auf künstlichen Antigen-präsentierenden Zellen (aAPCs) kultiviert werden, wie z.B. irradizierte K562-Zellen, die mit membrangebundenem IL-21 hergestellt wurden. Mit der Zufuhr von IL-2 in der Kultur kann mit dieser Methode eine 1.000-fache Erhöhung der NK-Zellzahlerreicht werden 3.
Eine weitere Einschränkung ist der eingeschränkte Zugang zu echten menschlichen NK-Zellen als positive Referenz. NK92mi ist die positive Referenz, die im Cokultur-Assay verwendet wird, aber es ist nicht genau genug. NK92mi-Zellen werden aus NK92-Zellen hergestellt, einer permanenten Zelllinie, die aktivierte NK-Zell-Phänotypen16 exprimiert, um IL-2 autonom zu produzieren, um die Kulturanforderungen zu erfüllen. NK92-Zellen zeigen in vitro eine überlegene Abtötungsaktivität gegenüber K562-Zellen als menschliche primäre NK-Zellen17. Ein fairerer Vergleich der tumorabtötenden Fähigkeit von IVD-Produkten könnte erreicht werden, indem die Zytotoxizität peripherer Blut-NK-Zellen parallel untersucht wird, aber leider fehlt der Zugang zu Blutbanken.
Dieses Zwei-System-Kulturprotokoll zielt darauf ab, CD3−/CD45+CD56+-Zellen aus hEPSCs zu erzeugen. Die Bewertung der Oberflächenmarker und der Zytotoxizität mit FACS kann routinemäßig an Zellen aus 2D-Systemen durchgeführt werden, ohne die Differenzierungsnische zu stören. Trotz der Unterschiede in den Prozentsätzen der CD3−CD56+-Zellen können die 3D- und 2D-Systeme CD3−CD56+-Zellen mit ähnlichen Variationen in der CD56-Expression ableiten (Abbildung 3), und das 2D-System spiegelt die Existenz von lymphatischen Vorläuferzellen aus dem 3D-Kulturzustand wider.
Die Bedeutung des 3D-Kultursystems besteht darin, dass es die Verwendung von hochauflösenden Profiling-Assays wie räumlicher Transkriptomik oder bildgebender Massenspektrometrie ermöglicht, um die räumlichen Beziehungen und Zell-Zell-Interaktionen innerhalb der komplexen Differenzierungsnische zu untersuchen.
The authors have nothing to disclose.
Wir danken Dr. Handi Cao, Sanxing GAO, David Xiang, Yiming Chao, Ritika Jogani, Owen Chan, Stephanie Cheung und Celine Chan für ihre technische Unterstützung und ihre nützlichen Diskussionen. Diese Arbeit wurde durch den Platform Technology Fund unterstützt. Abbildung 1 wurde mit BioRender.com erstellt.
30 w/v% Albumin Solution, from Bovine Serum(BSA), Fatty Acid Free | Wako Chemicals | 017-22231 | For resuspending cytokines. |
ACCUMAX | STEMCELL Technologies | 07921 | |
Anti-human-CD159a-PE | BD | 375104 | During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 5% FBS) |
Anti-human-CD3-APC antibodies | BD | 555355 | During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 2% FBS) |
Anti-human-CD45-APC antibodies | BD | 555485 | During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 3% FBS) |
Anti-human-CD56-PE antibodies | BD | 555516 | During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 4% FBS) |
Anti-human-CD56-PEcy7 antibodies | BD | 335826 | During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 5% FBS) |
Anti-human-CD94-APC | BD | 559876 | During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 5% FBS) |
Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film | Thermo Scientific | 11772644 | |
Cd244 Monoclonal Antibody (eBioC1.7 (C1.7)), Functional Grade, eBioscience | Thermo Scientific | 16-5838-85 | |
Costar 6.5 mm Transwell, 0.4 µm Pore Polyester Membrane Inserts | STEMCELL Technologies | 3470 | |
Dapi Solution, 1 mg/mL | BD | 564907 | It is resuspended with ddH2O so the concentration is 10 µM/mL. Add 1 µL of the aliquot in 300 µL of FACS buffer (PBS + 2% FBS) |
DMEM | CPOS-Bioreagent core | 11965092 | |
DMEM/F12 | Thermo Scientific | 11320033 | |
FcX, human | Biolengend | 422302 | |
Fetal Bovine Serum(FBS) qualified E.U.-approved South America | CPOS-Bioreagent core | 10270106 | |
FlowJo v10.8.0 | BD | ||
Gibco PBS (10x) pH 7.4 | CPOS-Bioreagent core | 70011044 | 10x concentrated PBS is manufactured as follows: without calcium, magnesium or phenol red |
K562 cells | ATCC | CCL-243 | |
Knockout Serum Replacement | Thermo Scientific | 10828-028 | |
MyeloCult H5100 medium | STEMCELL Technologies | 5150 | |
NK92mi cells | ATCC | CRL-2408 | Lot: 70045208. Once thawed, they are cultured in MyeloCult H5100 medium, and maintained the density between 2 x 105 to 1 x 106 cell/mL. |
Nunc Cell-Culture Treated Multidishes 12 well plate | Thermo Scientific | 150628 | flat bottom |
Nunc Cell-Culture Treated Multidishes 24 well plate | Thermo Scientific | 142475 | |
Nunc EasYDish Dishes | Thermo Scientific | 150460 | |
pLenti-GFP Lentiviral Control Vector | CELL BIOLABS | LTV-400 | It is packaged as the manufactuer suggested (https://www.cellbiolabs.com/sites/default/files/LTV-400-gfp- lentiviral-plasmid.pdf). 40 μL of 50x lentivirus is added with 1 μL 10 mg/mL polybrene per 1 mL of cell suspension. Complete medium change is performed 24 h after the addition of lentivirus. Cells are incubated undisputedly for 3 days at 37 °C, 5% CO2. |
Polybrene | EMD Millipore | TR-1003-G | |
Recombinant Human Flt-3 Ligand/FLT3L Protein | R&D Systems | 308-FK-005 | It is resuspend with PBS + 0.2% BSA. Thr working concentration is 10 ng/mL or 12 IU/mL. |
Recombinant Human IL-15 Protein | R&D Systems | 247-ILB-005 | It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 10 ng/mL or 4500 IU/mL. |
Recombinant Human IL-18/IL-1F4 Protein | R&D Systems | 9124-IL-010 | It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 50 ng/mL. The IU is not provided by the company. |
Recombinant Human IL-2 Protein | R&D Systems | 202-IL-010 | It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 50 ng/mL or 455 IU/mL. |
Recombinant Human IL-3 Protein, 50ug | PeproTech | 200-03 | It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 5 ng/mL or 14 IU/mL. |
Recombinant Human IL-7 Protein | R&D Systems | 207-IL-010 | It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 20 ng/mL or 8800 IU/mL. |
Recombinant Human SCF Protein | R&D Systems | 255-SC-010 | It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 20 ng/mL or 26 IU/mL. |
STEMdiff Hematopoietic Kit | STEMCELL Technologies | 5310 | Medium A: 45 mL STEMdiff Hematopoietic Basal Medium + STEMdiff Hematopoietic Supplement A ; Medium B: 75 STEMdiff Hematopoietic Basal Medium + STEMdiff Hematopoietic Supplement B |
StemSpan lymphoid differentiation coating material | STEMCELL Technologies | 9950 | It is resuspended in PBS (100x) |
StemSpan NK cell differentiation medium | STEMCELL Technologies | 9960 | It is prepared by adding 500 µL StemSpan NK Cell Differentiation Supplement (100x) into 49.5 mL of SFEM II. Both are provided in StemSpan NK Cell Generation Kit. |
StemSpan lymphoid expansion medium | STEMCELL Technologies | 9960 | It is prepared by adding 5 mL StemSpan Lymphoid Progenitor Expansion Supplement (10x) into 45 mL of StemSpan SFEM II. Both are provided in StemSpan NK Cell Generation Kit. |
StemSpan NK Cell Generation Kit | STEMCELL Technologies | 9960 | Thaw the medium and materials in room temperature and the medium is stored in 4 °C once thawed. |
The BD LSRFortessa cell analyzer | BD | ||
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Scientific | 25300054 | |
Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | working concentration: 10 µM |