Оценка эффективности органических пероксикислот для уничтожения молочных биопленок с использованием подхода, сочетающего статические и динамические методы
Summary
Этот протокол описывает подход, сочетающий статические и динамические методы для оценки эффективности органических пероксикислот для уничтожения биопленок в молочной промышленности. Этот подход также может быть использован для проверки эффективности новых биологических или химических составов для контроля биопленок.
Abstract
Наличие биопленок в молочной промышленности вызывает серьезную озабоченность, поскольку они могут привести к производству небезопасных и измененных молочных продуктов из-за их высокой устойчивости к большинству процедур безразборной мойки (CIP), часто используемых на перерабатывающих предприятиях. Поэтому крайне важно разработать новые стратегии борьбы с биопленкой для молочной промышленности. Этот протокол направлен на оценку эффективности органических пероксикислот (надуксусной, перпропионовой и пермолочной кислот и коммерческого дезинфицирующего средства на основе перуксусной кислоты) для уничтожения молочных биопленок с использованием комбинации статических и динамических методов. Все дезинфицирующие средства были протестированы на самых сильных бактериях, продуцирующих биопленку, в одной или смешанной биопленке с использованием анализа минимальной концентрации эрадикации биопленки (MBEC), статического метода скрининга с высокой пропускной способностью. Время контакта 5 минут с дезинфицирующими средствами в рекомендуемых концентрациях успешно уничтожило как одиночные, так и смешанные биопленки. В настоящее время продолжаются исследования, чтобы подтвердить эти наблюдения с использованием биопленочного реактора Центра по контролю за заболеваниями (CDC), динамического метода имитации условий in situ . Этот тип биореактора позволяет использовать поверхность из нержавеющей стали, которая составляет большинство промышленного оборудования и поверхностей. Предварительные результаты, полученные на реакторе, по-видимому, подтверждают эффективность органических пероксикислот против биопленок. Комбинированный подход, описанный в этом исследовании, может быть использован для разработки и тестирования новых биологических или химических составов для контроля биопленок и уничтожения микроорганизмов.
Introduction
Молочная промышленность является основным промышленным сектором во всем мире, в том числе в Канаде, где насчитывается более 10 500 молочных ферм, производящих почти 90 миллионов гл молока вгод1. Несмотря на строгие гигиенические требования, предъявляемые в молочной промышленности, в том числе на перерабатывающих предприятиях, молоко является отличной питательной средой для микроорганизмов, и, таким образом, молочные продукты могут содержать микроорганизмы, в том числе порчу или патогенные микроорганизмы. Эти возбудители могут вызывать различные заболевания; например, Salmonella sp. и Listeria monocytogenes могут вызывать гастроэнтерит и менингит соответственно2. Микроорганизмы, вызывающие порчу, могут влиять на качество и органолептические свойства молочных продуктов, производя газы, внеклеточные ферменты или кислоты3. Внешний вид и цвет молока также могут быть изменены, например, Pseudomonas spp.4.
Некоторые из этих микроорганизмов могут образовывать биопленки на различных поверхностях, в том числе на нержавеющей стали. Такие биопленки обеспечивают стойкость и размножение микроорганизмов на поверхности оборудования и, таким образом, загрязнение молочных продуктов5. Биопленки также проблематичны из-за их способности препятствовать теплопередаче и ускорять коррозию оборудования, что приводит к преждевременной замене оборудования и, следовательно, к экономическим потерям6.
Процедуры безразборной мойки (CIP) позволяют пищевой промышленности контролировать рост микроорганизмов. Эти процедуры включают последовательное использование гидроксида натрия, азотной кислоты и, иногда, дезинфицирующих средств, содержащих хлорноватистую кислоту и надуксусную кислоту 7,8. Хотя хлорноватистая кислота очень эффективна против микроорганизмов, она также вступает в реакцию с природным органическим веществом, вызывая образование токсичных побочных продуктов9. Надуксусная кислота не выделяет вредных побочных продуктов10; Однако его эффективность против биопленок в пищевой промышленности сильно варьирует10,11. В последнее время другие пероксикислоты, включая перпропионовую и пермолочную кислоты, были изучены на предмет их антимикробной активности, и они, по-видимому, являются хорошей альтернативой для контроля роста микробов в биопленках12,13.
Таким образом, это исследование было направлено на оценку эффективности органических пероксикислот (надуксусной, перпропионовой и пермолочной кислот и дезинфицирующего средства на основе перуксусной кислоты) для уничтожения молочных биопленок с использованием подхода, сочетающего анализ минимальной концентрации эрадикации биопленки (MBEC), статический высокопроизводительный метод скрининга и реактор биопленки Центра по контролю за заболеваниями (CDC), динамический метод, имитирующий in situ условия. Анализ MBEC в дальнейшем упоминается в протоколе как «микротитровальные планшеты с биопленкой». Представленный здесь протокол и репрезентативные результаты демонстрируют эффективность органических пероксикислот и их потенциальное применение для контроля микробных биопленок в молочной промышленности.
Protocol
Representative Results
Discussion
Анализ MBEC (анализ микропланшетов биопленки) был первым методом, который был признан стандартным тестом на эрадикацию биопленки ASTM17. Наше исследование и другие показали, что при использовании этого анализа есть два критических этапа: этап обработки ультразвуком (время и мо?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано Консорциумом исследований и инноваций в области биопроцессов в промышленности Квебека (CRIBIQ) (2016-049-C22), Agropur, Groupe Sani Marc и Советом по естественным наукам и инженерным исследованиям Канады (NSERC) (RDCPJ516460-17). Благодарим Терезу Паникони за критическую рецензию на рукопись.
Materials
| 0.2 µm filters | Corning | 09-754-28 | diameter: 50 mm, PTFE- Membrane |
| 316 stainless-steel disc coupon | Biosurface Technologies Corporation | RD128-316 | |
| 316 stainless-steel slide coupon | Biosurface Technologies Corporation | CBR 2128-316 | |
| 96-microtiter plate | Corning | 07-200-89 | cell Culture-Treated, flat-Bottom Microplate |
| Acetic acid | Sigma Aldrich | 27225 | store at RT |
| Aluminium stubs | Electron Microscopy Science | 75830-10 | 32x5mm |
| Aqueous glutaraldehyde EM Grade 25% | Electron Microscopy Sciences | 16220 | store at -20 °C |
| AB204-S/FACT Analytical balance | Mettler Toledo | AB204-S | |
| Bacterial Vent Filter (0.45 µm) | Biosurface Technologies Corporation | BST 02915 | |
| BioDestroy | Groupe Sani Marc | 09-10215 | commercial peracetic acid-based disinfectant, store at RT |
| Carboy LDPE 20 L | Cole Parmer | 06031-52 | |
| CDC biofilm reactor | Biosurface Technologies Corporation | CRB 90 | bioreactor |
| Cerium (IV) sulphate | Thermo Scientific | 35650-K2 | store at RT |
| Confocal laser scanning microscope LSM 700 | Zeiss | LSM 700 | |
| Dey-Engley neutralizing broth | Millipore | D3435-500G | store at 4 °C |
| EMS950x + 350s gold sputter | Electron Microscopy Sciences | ||
| Epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | 14121 | with BDMA |
| Ethyl alcohol 95%, USP | Greenfield global | P016EA95 | store at RT |
| Ferroin indicator solution | Sigma Aldrich | 318922-100ML | store at RT |
| Filling/venting cap | Cole Parmer | RK-06258-00 | |
| FilmTracer LIVE/DEAD Biofilm Viability Kit | Invitrogen | L10316 | fluorescent cell viability kit (SYTO 9: green fluorescent stain, Propidium iodide: red fluorescent stain), store at – 20 °C |
| Glass flow break | Biosurface Technologies Corporation | FB 50 | |
| Gold with silver paint | Electron Microscopy Sciences | 12684-15 | |
| Heating plate set | Biosurface Technologies Corporation | 110V Stir Plate | |
| Hex screwdriver | Biosurface Technologies Corporation | CBR 5497 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | 216763 | store at 4 °C |
| Inoculating loops | VWR | 12000-812 | sterile, 10 µl |
| Lactic acid | Laboratoire MAT | LU-0200 | store at RT |
| MASTERFLEX L/S 7557-04 W/ 7557-02 with EASY-LOAD II peristaltic pump and 77200-50 Head | Cole Parmer | 77200-60 | |
| MBEC (Minimum Biofilm Eradication Concentration) assay biofilm inoculator with a 96-well base | Innovotech | 19111 | Biofilm microtiter plate |
| Oxford agar base | Thermo Scientific | OXCM0856B | store at 4 °C |
| Plastic coupon holder | Biosurface Technologies Corporation | CBR 2203 | |
| Plastic slide holder rod | Biosurface Technologies Corporation | CBR 2203-GL | |
| Potassium iodide | Fisher Chemical | P410-500 | store at RT |
| Precision slotted screwdriver (1.5 mm x 40 mm) | Wiha | 26015 | |
| Propionic acid | Laboratoire MAT | PF-0221 | store at RT |
| Sartorius BCE822-1S Entris® II Basic Essential Toploading Balance | Cole Parmer | UZ-11976-3 | |
| Scanning electron microscope JSM-6360LV model | JEOL | JSM-6360LV | SEM and user control interface |
| Screw cap tube, 15 mL | Sarstedt | 62.554.205 | (LxØ): 120 x 17 mm, material: PP, conical base, transparent, HD-PE |
| Screw cap tube, 50 mL | Sarstedt | 62.547.205 | (LxØ): 114 x 28 mm, material: PP, conical base, transparent, HD-PE |
| Sodium Cacodylate Trihydrate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | store at -20 °C |
| Sodium thiosulfate | Thermo Scientific | AC124270010 | store at RT |
| Sonication bath | Fisher | 15-336-122 | 5,7 L |
| Starch solution | Anachemia | AC8615 | store at RT |
| Sulfuric acid | Sigma Aldrich | 258105-500ML | store at RT |
| Tryptic soy agar | BD Bacto | DF0369-17-6 | store at RT |
| Tryptic soy broth | BD Bacto | DF0370-17-3 | store at RT |
| Tubing Masterflex L/S 16 25' | Cole Parmer | MFX0642416 | |
| Tubing Masterflex L/S 18 25' | Cole Parmer | MFX0642418 | |
| Tygon SPT-3350 silicon tubing | Saint-Gobain | ABW18NSF | IDx OD: 1/4 in.x 7/16 in. |
| Vortex | Cole Palmer | UZ-04724-00 | |
| Water bath | VWR | 89202-970 | |
| Zen software | Zeiss |
Referências
- Canada’s dairy industry at a glance. Canadian Dairy Information Centre Available from: https://agriculture.canada.ca/en/canadas-agriculture-sectors/animal-industry/canadian-dairy-information-centre/canadas-dairy-industry-glance (2017)
- Oliver, S. P., Jayarao, B. M., Almeida, R. A. Foodborne pathogens in milk and the dairy farm environment: food safety and public health implications. Foodborne Pathogens and Disease. 2 (2), 115-129 (2005).
- Fondation de technologie laitière du Québec. . Science et technologie du lait. 3rd edn. , (2018).
- Evanowski, R., et al. Short communication: Pseudomonas azotoformans causes gray discoloration in HTST fluid milk. Journal of dairy science. 100, 7906-7909 (2017).
- Bower, C. K., McGuire, J., Daeschel, M. A. The adhesion and detachment of bacteria and spores on food-contact surfaces. Trends in Food Science & Technology. 7 (5), 152-157 (1996).
- Gupta, S., Anand, S. Induction of pitting corrosion on stainless steel (grades 304 and 316) used in dairy industry by biofilms of common sporeformers. International Journal of Dairy Technology. 71 (2), 519-531 (2018).
- Marchand, S., et al. Biofilm formation in milk production and processing environments; Influence on milk quality and safety. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 11 (2), 133-147 (2012).
- Silva, H. O., et al. Efficiency of different disinfectants on Bacillus cereus sensu stricto biofilms on stainless-steel surfaces in contact with milk. Frontiers in Microbiology. 9, 2934 (2018).
- Sedlak, D. L., von Gunten, U. Chemistry. The chlorine dilemma. Science. 331 (6013), 42-43 (2011).
- vander Veen, S., Abee, T. Mixed species biofilms of Listeria monocytogenes and Lactobacillus plantarum show enhanced resistance to benzalkonium chloride and peracetic acid. International Journal of Food Microbiology. 144 (3), 421-431 (2011).
- Saa Ibusquiza, P., Herrera, J. J., Cabo, M. L. Resistance to benzalkonium chloride, peracetic acid and nisin during formation of mature biofilms by Listeria monocytogenes. Food Microbiology. 28 (3), 418-425 (2011).
- Goetz, C., Larouche, J., Velez Aristizabal, M., Niboucha, N., Jean, J. Efficacy of organic peroxyacids for eliminating biofilm preformed by microorganisms isolated from dairy processing plants. Applied and Environmental Microbiology. 88 (4), 0188921 (2022).
- Vimont, A., Fliss, I., Jean, J. Study of the virucidal potential of organic peroxyacids against norovirus on food-contact surfaces. Food and Environmental Virology. 7 (1), 49-57 (2015).
- ASTM E2562-17. Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown with High Shear and Continuous Flow using CDC Biofilm Reactor. ASTM International Available from: https://www.astm.org/e2562-17.html (2017)
- ASTM E2871-19. Standard Test Method for Evaluating Disinfectant Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown in CDC Biofilm Reactor Using Single Tube Method. ASTM International Available from: https://www.astm.org/e2871-19.html (2019)
- Niboucha, N., et al. Comparative study of different sampling methods of biofilm formed on stainless-steel surfaces in a CDC biofilm reactor. Frontiers in Microbiology. 13, 892181 (2022).
- ASTM E2799-17. Standard Test Method for Testing Disinfectant Efficacy against Pseudomonas aeruginosa Biofilm using the MBEC Assay. ASTM International Available from: https://www.astm.org/e2799-17.html (2022)
- Parker, A. E., et al. Ruggedness and reproducibility of the MBEC biofilm disinfectant efficacy test. Journal of Microbiological Methods. 102, 55-64 (2014).
- Stewart, P. S., Parker, A. E. Measuring antimicrobial efficacy against biofilms: A meta-analysis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (5), 00020 (2019).
- Lindsay, D. K., Fouhy, K., Loh, M., Malakar, P. The CDC biofilm bioreactor is a suitable method to grow biofilms, and test their sanitiser susceptibilities, in the dairy context. International Dairy Journal. 126, 105264 (2022).
- Buckingham-Meyer, K., Goeres, D. M., Hamilton, M. A. Comparative evaluation of biofilm disinfectant efficacy tests. Journal of Microbiological Methods. 70 (2), 236-244 (2007).
- Goeres, D. M., et al. Statistical assessment of a laboratory method for growing biofilms. Microbiology (Reading). 151, 757-762 (2005).
- Williams, D. L., Woodbury, K. L., Haymond, B. S., Parker, A. E., Bloebaum, R. D. A modified CDC biofilm reactor to produce mature biofilms on the surface of peek membranes for an in vivo animal model application. Current Microbiology. 62 (6), 1657-1663 (2011).
- Pieranski, M. K., Rychlowski, M., Grinholc, M. Optimization of Streptococcus agalactiae biofilm culture in a continuous flow system for photoinactivation studies. Pathogens. 10 (9), 1212 (2021).
- Mendez, E., Walker, D. K., Vipham, J., Trinetta, V. The use of a CDC biofilm reactor to grow multi-strain Listeria monocytogenes biofilm. Food Microbiology. 92, 103592 (2020).
- Salgar-Chaparro, S. J., Lepkova, K., Pojtanabuntoeng, T., Darwin, A., Machuca, L. L. Nutrient level determines biofilm characteristics and subsequent impact on microbial corrosion and biocide effectiveness. Applied and Environmental Microbiology. 86 (7), 02885 (2020).
- Goeres, D. M., Simoes, M., Borges, A., Chaves Simoes, L., et al. Design and Fabrication of Biofilm Reactors. Recent Trends in Biofilm Science and Technology. , 71-88 (2020).
- Fjeld, C. S., Schüller, R. B. Biofilm formation during hexadecane degradation and the effects of flow field and shear stresses. Annual Transactions – The Nordic Rheology Society. 21, 341-346 (2013).
- Gilmore, B. F., Hamill, T. M., Jones, D. S., Gorman, S. P. Validation of the CDC biofilm reactor as a dynamic model for assessment of encrustation formation on urological device materials. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 93 (1), 128-140 (2010).
- Picioreanu, C., van Loosdrecht, M. C., Heijnen, J. J. Two-dimensional model of biofilm detachment caused by internal stress from liquid flow. Biotechnology and Bioengineering. 72 (2), 205-218 (2001).
