Ce protocole décrit une approche combinant des méthodes statiques et dynamiques pour évaluer l’efficacité des peroxyacides organiques pour l’éradication des biofilms dans l’industrie laitière. Cette approche peut également être utilisée pour tester l’efficacité de nouvelles formulations biologiques ou chimiques pour contrôler les biofilms.
La présence de biofilms dans l’industrie laitière est très préoccupante, car ils peuvent conduire à la production de produits laitiers dangereux et altérés en raison de leur résistance élevée à la plupart des procédures de nettoyage en place (NEP) fréquemment utilisées dans les usines de transformation. Par conséquent, il est impératif de développer de nouvelles stratégies de contrôle du biofilm pour l’industrie laitière. Ce protocole vise à évaluer l’efficacité des peroxyacides organiques (acides peracétique, perpropionique et perlactique et un désinfectant commercial à base d’acide peracétique) pour éradiquer les biofilms laitiers en utilisant une combinaison de méthodes statiques et dynamiques. Tous les désinfectants ont été testés sur les bactéries productrices de biofilm les plus fortes dans un biofilm unique ou mixte à l’aide du test de concentration minimale d’éradication du biofilm (MBEC), une méthode de criblage statique à haut débit. Un temps de contact de 5 min avec les désinfectants aux concentrations recommandées a permis d’éradiquer avec succès les biofilms simples et mélangés. Des études sont actuellement en cours pour confirmer ces observations à l’aide du réacteur à biofilm du Center for Disease Control (CDC), une méthode dynamique pour imiter les conditions in situ . Ce type de bioréacteur permet l’utilisation d’une surface en acier inoxydable, qui constitue la plupart des équipements et surfaces industriels. Les résultats préliminaires du réacteur semblent confirmer l’efficacité des peroxyacides organiques contre les biofilms. L’approche combinée décrite dans cette étude peut être utilisée pour développer et tester de nouvelles formulations biologiques ou chimiques pour contrôler les biofilms et éradiquer les microorganismes.
L’industrie laitière est un secteur industriel important à l’échelle mondiale, y compris au Canada, où l’on compte plus de 10 500 fermes laitières produisant près de 90 millions d’hL de lait chaque année1. Malgré les exigences strictes en matière d’hygiène imposées dans l’industrie laitière, y compris dans les usines de transformation, le lait constitue un excellent milieu de culture pour les micro-organismes et, par conséquent, les produits laitiers sont susceptibles de contenir des micro-organismes, y compris des micro-organismes pathogènes ou d’altération. Ces agents pathogènes peuvent causer diverses maladies; par exemple, Salmonella sp. et Listeria monocytogenes peuvent causer une gastro-entérite et une méningite, respectivement2. Les microorganismes d’altération peuvent affecter la qualité et les propriétés organoleptiques des produits laitiers en produisant des gaz, des enzymes extracellulaires ou des acides3. L’apparence et la couleur du lait peuvent également être modifiées, par exemple par Pseudomonas spp.4.
Certains de ces micro-organismes peuvent former des biofilms sur différentes surfaces, y compris l’acier inoxydable. De tels biofilms permettent la persistance et la multiplication de micro-organismes à la surface de l’équipement et, par conséquent, la contamination des produits laitiers5. Les biofilms sont également problématiques en raison de leur capacité à entraver le transfert de chaleur et à accélérer la corrosion de l’équipement, ce qui entraîne un remplacement prématuré de l’équipement et, par conséquent, des pertes économiques6.
Les procédures de nettoyage en place (NEP) permettent à l’industrie alimentaire de contrôler la croissance des micro-organismes. Ces procédures impliquent l’utilisation séquentielle d’hydroxyde de sodium, d’acide nitrique et, parfois, d’assainissants contenant de l’acide hypochloreux et de l’acide peracétique 7,8. Bien que l’acide hypochloreux soit très efficace contre les micro-organismes, il réagit également avec la matière organique naturelle, provoquant la formation de sous-produits toxiques9. L’acide peracétique ne génère pas de sous-produits nocifs10; Cependant, son efficacité contre les biofilms dans l’industrie alimentaire est très variable10,11. Récemment, d’autres peroxyacides, y compris les acides perpropionique et perlactique, ont été étudiés pour leur activité antimicrobienne, et ils semblent être une bonne alternative pour le contrôle de la croissance microbienne dans les biofilms12,13.
Par conséquent, cette étude visait à évaluer l’efficacité des peroxyacides organiques (acides peracétique, perpropionique et perlactique et un désinfectant à base d’acide peracétique) pour éradiquer les biofilms laitiers en utilisant une approche combinant le test de concentration minimale d’éradication du biofilm (MBEC), une méthode de criblage statique à haut débit et le réacteur à biofilm du Center for Disease Control (CDC), une méthode dynamique qui imite in situ . conditions. Le test MBEC est ci-après appelé « plaques de microtitrage de biofilm » dans le protocole. Le protocole présenté ici et les résultats représentatifs démontrent l’efficacité des peroxyacides organiques et leur application potentielle pour le contrôle des biofilms microbiens dans l’industrie laitière.
Le test MBEC (essai sur microplaque de biofilm) a été la première méthode à être reconnue comme un test standard d’éradication du biofilm par l’ASTM17. Notre étude et d’autres ont montré qu’il y a deux étapes critiques lors de l’utilisation de ce test: l’étape de sonication (temps et puissance) et le temps de traitement désinfectant18. Stewart et Parker ont également suggéré d’autres paramètres qui pourraient influencer le résultat du test, te…
The authors have nothing to disclose.
Cette recherche a été financée par le Consortium de recherche et innovations en bioprocédés industriels au Québec (CRIBIQ)(2016-049-C22), Agropur, Groupe Sani Marc et le Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG) (RDCPJ516460-17). Nous remercions Teresa Paniconi pour la critique du manuscrit.
0.2 µm filters | Corning | 09-754-28 | diameter: 50 mm, PTFE- Membrane |
316 stainless-steel disc coupon | Biosurface Technologies Corporation | RD128-316 | |
316 stainless-steel slide coupon | Biosurface Technologies Corporation | CBR 2128-316 | |
96-microtiter plate | Corning | 07-200-89 | cell Culture-Treated, flat-Bottom Microplate |
Acetic acid | Sigma Aldrich | 27225 | store at RT |
Aluminium stubs | Electron Microscopy Science | 75830-10 | 32x5mm |
Aqueous glutaraldehyde EM Grade 25% | Electron Microscopy Sciences | 16220 | store at -20 °C |
AB204-S/FACT Analytical balance | Mettler Toledo | AB204-S | |
Bacterial Vent Filter (0.45 µm) | Biosurface Technologies Corporation | BST 02915 | |
BioDestroy | Groupe Sani Marc | 09-10215 | commercial peracetic acid-based disinfectant, store at RT |
Carboy LDPE 20 L | Cole Parmer | 06031-52 | |
CDC biofilm reactor | Biosurface Technologies Corporation | CRB 90 | bioreactor |
Cerium (IV) sulphate | Thermo Scientific | 35650-K2 | store at RT |
Confocal laser scanning microscope LSM 700 | Zeiss | LSM 700 | |
Dey-Engley neutralizing broth | Millipore | D3435-500G | store at 4 °C |
EMS950x + 350s gold sputter | Electron Microscopy Sciences | ||
Epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | 14121 | with BDMA |
Ethyl alcohol 95%, USP | Greenfield global | P016EA95 | store at RT |
Ferroin indicator solution | Sigma Aldrich | 318922-100ML | store at RT |
Filling/venting cap | Cole Parmer | RK-06258-00 | |
FilmTracer LIVE/DEAD Biofilm Viability Kit | Invitrogen | L10316 | fluorescent cell viability kit (SYTO 9: green fluorescent stain, Propidium iodide: red fluorescent stain), store at – 20 °C |
Glass flow break | Biosurface Technologies Corporation | FB 50 | |
Gold with silver paint | Electron Microscopy Sciences | 12684-15 | |
Heating plate set | Biosurface Technologies Corporation | 110V Stir Plate | |
Hex screwdriver | Biosurface Technologies Corporation | CBR 5497 | |
Hydrogen peroxide | Sigma | 216763 | store at 4 °C |
Inoculating loops | VWR | 12000-812 | sterile, 10 µl |
Lactic acid | Laboratoire MAT | LU-0200 | store at RT |
MASTERFLEX L/S 7557-04 W/ 7557-02 with EASY-LOAD II peristaltic pump and 77200-50 Head | Cole Parmer | 77200-60 | |
MBEC (Minimum Biofilm Eradication Concentration) assay biofilm inoculator with a 96-well base | Innovotech | 19111 | Biofilm microtiter plate |
Oxford agar base | Thermo Scientific | OXCM0856B | store at 4 °C |
Plastic coupon holder | Biosurface Technologies Corporation | CBR 2203 | |
Plastic slide holder rod | Biosurface Technologies Corporation | CBR 2203-GL | |
Potassium iodide | Fisher Chemical | P410-500 | store at RT |
Precision slotted screwdriver (1.5 mm x 40 mm) | Wiha | 26015 | |
Propionic acid | Laboratoire MAT | PF-0221 | store at RT |
Sartorius BCE822-1S Entris® II Basic Essential Toploading Balance | Cole Parmer | UZ-11976-3 | |
Scanning electron microscope JSM-6360LV model | JEOL | JSM-6360LV | SEM and user control interface |
Screw cap tube, 15 mL | Sarstedt | 62.554.205 | (LxØ): 120 x 17 mm, material: PP, conical base, transparent, HD-PE |
Screw cap tube, 50 mL | Sarstedt | 62.547.205 | (LxØ): 114 x 28 mm, material: PP, conical base, transparent, HD-PE |
Sodium Cacodylate Trihydrate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | store at -20 °C |
Sodium thiosulfate | Thermo Scientific | AC124270010 | store at RT |
Sonication bath | Fisher | 15-336-122 | 5,7 L |
Starch solution | Anachemia | AC8615 | store at RT |
Sulfuric acid | Sigma Aldrich | 258105-500ML | store at RT |
Tryptic soy agar | BD Bacto | DF0369-17-6 | store at RT |
Tryptic soy broth | BD Bacto | DF0370-17-3 | store at RT |
Tubing Masterflex L/S 16 25' | Cole Parmer | MFX0642416 | |
Tubing Masterflex L/S 18 25' | Cole Parmer | MFX0642418 | |
Tygon SPT-3350 silicon tubing | Saint-Gobain | ABW18NSF | IDx OD: 1/4 in.x 7/16 in. |
Vortex | Cole Palmer | UZ-04724-00 | |
Water bath | VWR | 89202-970 | |
Zen software | Zeiss |