Utvärdering av effekten av organiska peroxisyror för att utrota mejeribiofilmer med hjälp av en metod som kombinerar statiska och dynamiska metoder
Summary
Detta protokoll beskriver ett tillvägagångssätt som kombinerar statiska och dynamiska metoder för att utvärdera effekten av organiska peroxisyror för att utrota biofilmer i mejeriindustrin. Detta tillvägagångssätt kan också användas för att testa effektiviteten hos nya biologiska eller kemiska formuleringar för kontroll av biofilmer.
Abstract
Förekomsten av biofilmer inom mejeriindustrin är mycket oroande, eftersom de kan leda till produktion av osäkra och förändrade mejeriprodukter på grund av deras höga motståndskraft mot de flesta CIP-förfaranden som ofta används i bearbetningsanläggningar. Därför är det absolut nödvändigt att utveckla nya biofilmkontrollstrategier för mejeriindustrin. Detta protokoll syftar till att utvärdera effekten av organiska peroxisyror (perättiksyra, perpropionsyra och perlaktiska syror och ett kommersiellt perättiksyrabaserat desinfektionsmedel) för att utrota mejeribiofilmer med en kombination av statiska och dynamiska metoder. Alla desinfektionsmedel testades på de starkaste biofilmproducerande bakterierna i antingen en enda eller en blandad biofilm med hjälp av MBEC-analysen (minimum biofilm eradication concentration), en statisk screeningmetod med hög kapacitet. En kontakttid på 5 minuter med desinfektionsmedlen vid rekommenderade koncentrationer utrotade framgångsrikt både den enskilda och blandade biofilmen. Studier pågår för närvarande för att bekräfta dessa observationer med hjälp av Center for Disease Control (CDC) biofilmreaktor, en dynamisk metod för att efterlikna in situ-förhållanden . Denna typ av bioreaktor möjliggör användning av en rostfri yta, som utgör de flesta industriella utrustningar och ytor. De preliminära resultaten från reaktorn verkar bekräfta effekten av organiska peroxisyror mot biofilmer. Det kombinerade tillvägagångssättet som beskrivs i denna studie kan användas för att utveckla och testa nya biologiska eller kemiska formuleringar för att kontrollera biofilmer och utrota mikroorganismer.
Introduction
Mejeriindustrin är en stor industrisektor över hela världen, inklusive i Kanada, där det finns mer än 10 500 mjölkgårdar som producerar nästan 90 miljoner hL mjölk varje år1. Trots de strikta hygienkraven inom mejeriindustrin, inklusive i bearbetningsanläggningar, utgör mjölk ett utmärkt odlingsmedium för mikroorganismer, och därför kommer mejeriprodukter sannolikt att innehålla mikroorganismer, inklusive förstörelse eller patogena mikroorganismer. Dessa patogener kan orsaka olika sjukdomar; till exempel kan Salmonella sp. och Listeria monocytogenes orsaka gastroenterit respektivemeningit 2. Nedbrytningsmikroorganismer kan påverka kvaliteten och organoleptiska egenskaper hos mejeriprodukter genom att producera gaser, extracellulära enzymer eller syror3. Mjölkens utseende och färg kan också ändras, t.ex. genom Pseudomonas spp.4.
Några av dessa mikroorganismer kan bilda biofilmer på olika ytor, inklusive rostfritt stål. Sådana biofilmer möjliggör persistens och multiplikation av mikroorganismer på utrustningens yta och därmed kontaminering av mejeriprodukterna5. Biofilmer är också problematiska på grund av deras förmåga att hindra värmeöverföring och påskynda korrosion av utrustningen, vilket leder till för tidigt utbyte av utrustningen och därmed till ekonomiska förluster6.
Clean-in-place (CIP) -procedurer gör det möjligt för livsmedelsindustrin att kontrollera tillväxten av mikroorganismer. Dessa förfaranden innefattar sekventiell användning av natriumhydroxid, salpetersyra och ibland desinfektionsmedel innehållande hypoklorsyra och perättiksyra 7,8. Även om hypoklorsyra är mycket effektiv mot mikroorganismer, reagerar den också med naturligt organiskt material, vilket orsakar bildandet av giftiga biprodukter9. Perättiksyra genererar inte skadliga biprodukter10; Dess effektivitet mot biofilmer i livsmedelsindustrin är dock mycket varierande10,11. Nyligen har andra peroxisyror, inklusive perpropionsyra och perlaktiska syror, studerats för sin antimikrobiella aktivitet, och de verkar vara ett bra alternativ för kontroll av mikrobiell tillväxt i biofilmer12,13.
Därför syftade denna studie till att utvärdera effekten av organiska peroxisyror (perättiksyra, perpropionsyra och permjölksyra och ett perättiksyrabaserat desinfektionsmedel) för att utrota mejeribiofilmer med hjälp av ett tillvägagångssätt som kombinerar MBEC-analysen (minimum biofilm eradication concentration), en statisk screeningmetod med hög genomströmning och Center for Disease Control (CDC) biofilmreaktor, en dynamisk metod som efterliknar in situ Villkor. MBEC-analysen kallas nedan “biofilmmikrotiterplattor” i protokollet. Protokollet som presenteras här och de representativa resultaten visar effekten av organiska peroxisyror och deras potentiella tillämpning för att kontrollera mikrobiella biofilmer i mejeriindustrin.
Protocol
Representative Results
Discussion
MBEC-analysen (biofilm microplate assay) var den första metoden som erkändes som ett standardtest för utrotning av biofilm av ASTM17. Vår studie och andra har visat att det finns två kritiska steg när du använder denna analys: ultraljudsbehandlingssteget (tid och kraft) och desinfektionsmedelsbehandlingstiden18. Stewart och Parker föreslog också andra parametrar som kan påverka resultatet av analysen, såsom mikrobiella arter, biofilmålder, ytarea / volymförhål…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöddes av Consortium de Recherche et Innovations en Bioprocédés Industriels au Québec (CRIBIQ) (2016-049-C22), Agropur, Groupe Sani Marc och Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) (RDCPJ516460-17). Vi tackar Teresa Paniconi för den kritiska granskningen av manuskriptet.
Materials
| 0.2 µm filters | Corning | 09-754-28 | diameter: 50 mm, PTFE- Membrane |
| 316 stainless-steel disc coupon | Biosurface Technologies Corporation | RD128-316 | |
| 316 stainless-steel slide coupon | Biosurface Technologies Corporation | CBR 2128-316 | |
| 96-microtiter plate | Corning | 07-200-89 | cell Culture-Treated, flat-Bottom Microplate |
| Acetic acid | Sigma Aldrich | 27225 | store at RT |
| Aluminium stubs | Electron Microscopy Science | 75830-10 | 32x5mm |
| Aqueous glutaraldehyde EM Grade 25% | Electron Microscopy Sciences | 16220 | store at -20 °C |
| AB204-S/FACT Analytical balance | Mettler Toledo | AB204-S | |
| Bacterial Vent Filter (0.45 µm) | Biosurface Technologies Corporation | BST 02915 | |
| BioDestroy | Groupe Sani Marc | 09-10215 | commercial peracetic acid-based disinfectant, store at RT |
| Carboy LDPE 20 L | Cole Parmer | 06031-52 | |
| CDC biofilm reactor | Biosurface Technologies Corporation | CRB 90 | bioreactor |
| Cerium (IV) sulphate | Thermo Scientific | 35650-K2 | store at RT |
| Confocal laser scanning microscope LSM 700 | Zeiss | LSM 700 | |
| Dey-Engley neutralizing broth | Millipore | D3435-500G | store at 4 °C |
| EMS950x + 350s gold sputter | Electron Microscopy Sciences | ||
| Epoxy resin | Electron Microscopy Sciences | 14121 | with BDMA |
| Ethyl alcohol 95%, USP | Greenfield global | P016EA95 | store at RT |
| Ferroin indicator solution | Sigma Aldrich | 318922-100ML | store at RT |
| Filling/venting cap | Cole Parmer | RK-06258-00 | |
| FilmTracer LIVE/DEAD Biofilm Viability Kit | Invitrogen | L10316 | fluorescent cell viability kit (SYTO 9: green fluorescent stain, Propidium iodide: red fluorescent stain), store at – 20 °C |
| Glass flow break | Biosurface Technologies Corporation | FB 50 | |
| Gold with silver paint | Electron Microscopy Sciences | 12684-15 | |
| Heating plate set | Biosurface Technologies Corporation | 110V Stir Plate | |
| Hex screwdriver | Biosurface Technologies Corporation | CBR 5497 | |
| Hydrogen peroxide | Sigma | 216763 | store at 4 °C |
| Inoculating loops | VWR | 12000-812 | sterile, 10 µl |
| Lactic acid | Laboratoire MAT | LU-0200 | store at RT |
| MASTERFLEX L/S 7557-04 W/ 7557-02 with EASY-LOAD II peristaltic pump and 77200-50 Head | Cole Parmer | 77200-60 | |
| MBEC (Minimum Biofilm Eradication Concentration) assay biofilm inoculator with a 96-well base | Innovotech | 19111 | Biofilm microtiter plate |
| Oxford agar base | Thermo Scientific | OXCM0856B | store at 4 °C |
| Plastic coupon holder | Biosurface Technologies Corporation | CBR 2203 | |
| Plastic slide holder rod | Biosurface Technologies Corporation | CBR 2203-GL | |
| Potassium iodide | Fisher Chemical | P410-500 | store at RT |
| Precision slotted screwdriver (1.5 mm x 40 mm) | Wiha | 26015 | |
| Propionic acid | Laboratoire MAT | PF-0221 | store at RT |
| Sartorius BCE822-1S Entris® II Basic Essential Toploading Balance | Cole Parmer | UZ-11976-3 | |
| Scanning electron microscope JSM-6360LV model | JEOL | JSM-6360LV | SEM and user control interface |
| Screw cap tube, 15 mL | Sarstedt | 62.554.205 | (LxØ): 120 x 17 mm, material: PP, conical base, transparent, HD-PE |
| Screw cap tube, 50 mL | Sarstedt | 62.547.205 | (LxØ): 114 x 28 mm, material: PP, conical base, transparent, HD-PE |
| Sodium Cacodylate Trihydrate | Electron Microscopy Sciences | 12300 | store at -20 °C |
| Sodium thiosulfate | Thermo Scientific | AC124270010 | store at RT |
| Sonication bath | Fisher | 15-336-122 | 5,7 L |
| Starch solution | Anachemia | AC8615 | store at RT |
| Sulfuric acid | Sigma Aldrich | 258105-500ML | store at RT |
| Tryptic soy agar | BD Bacto | DF0369-17-6 | store at RT |
| Tryptic soy broth | BD Bacto | DF0370-17-3 | store at RT |
| Tubing Masterflex L/S 16 25' | Cole Parmer | MFX0642416 | |
| Tubing Masterflex L/S 18 25' | Cole Parmer | MFX0642418 | |
| Tygon SPT-3350 silicon tubing | Saint-Gobain | ABW18NSF | IDx OD: 1/4 in.x 7/16 in. |
| Vortex | Cole Palmer | UZ-04724-00 | |
| Water bath | VWR | 89202-970 | |
| Zen software | Zeiss |
Referências
- Canada’s dairy industry at a glance. Canadian Dairy Information Centre Available from: https://agriculture.canada.ca/en/canadas-agriculture-sectors/animal-industry/canadian-dairy-information-centre/canadas-dairy-industry-glance (2017)
- Oliver, S. P., Jayarao, B. M., Almeida, R. A. Foodborne pathogens in milk and the dairy farm environment: food safety and public health implications. Foodborne Pathogens and Disease. 2 (2), 115-129 (2005).
- Fondation de technologie laitière du Québec. . Science et technologie du lait. 3rd edn. , (2018).
- Evanowski, R., et al. Short communication: Pseudomonas azotoformans causes gray discoloration in HTST fluid milk. Journal of dairy science. 100, 7906-7909 (2017).
- Bower, C. K., McGuire, J., Daeschel, M. A. The adhesion and detachment of bacteria and spores on food-contact surfaces. Trends in Food Science & Technology. 7 (5), 152-157 (1996).
- Gupta, S., Anand, S. Induction of pitting corrosion on stainless steel (grades 304 and 316) used in dairy industry by biofilms of common sporeformers. International Journal of Dairy Technology. 71 (2), 519-531 (2018).
- Marchand, S., et al. Biofilm formation in milk production and processing environments; Influence on milk quality and safety. Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety. 11 (2), 133-147 (2012).
- Silva, H. O., et al. Efficiency of different disinfectants on Bacillus cereus sensu stricto biofilms on stainless-steel surfaces in contact with milk. Frontiers in Microbiology. 9, 2934 (2018).
- Sedlak, D. L., von Gunten, U. Chemistry. The chlorine dilemma. Science. 331 (6013), 42-43 (2011).
- vander Veen, S., Abee, T. Mixed species biofilms of Listeria monocytogenes and Lactobacillus plantarum show enhanced resistance to benzalkonium chloride and peracetic acid. International Journal of Food Microbiology. 144 (3), 421-431 (2011).
- Saa Ibusquiza, P., Herrera, J. J., Cabo, M. L. Resistance to benzalkonium chloride, peracetic acid and nisin during formation of mature biofilms by Listeria monocytogenes. Food Microbiology. 28 (3), 418-425 (2011).
- Goetz, C., Larouche, J., Velez Aristizabal, M., Niboucha, N., Jean, J. Efficacy of organic peroxyacids for eliminating biofilm preformed by microorganisms isolated from dairy processing plants. Applied and Environmental Microbiology. 88 (4), 0188921 (2022).
- Vimont, A., Fliss, I., Jean, J. Study of the virucidal potential of organic peroxyacids against norovirus on food-contact surfaces. Food and Environmental Virology. 7 (1), 49-57 (2015).
- ASTM E2562-17. Standard Test Method for Quantification of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown with High Shear and Continuous Flow using CDC Biofilm Reactor. ASTM International Available from: https://www.astm.org/e2562-17.html (2017)
- ASTM E2871-19. Standard Test Method for Evaluating Disinfectant Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa Biofilm Grown in CDC Biofilm Reactor Using Single Tube Method. ASTM International Available from: https://www.astm.org/e2871-19.html (2019)
- Niboucha, N., et al. Comparative study of different sampling methods of biofilm formed on stainless-steel surfaces in a CDC biofilm reactor. Frontiers in Microbiology. 13, 892181 (2022).
- ASTM E2799-17. Standard Test Method for Testing Disinfectant Efficacy against Pseudomonas aeruginosa Biofilm using the MBEC Assay. ASTM International Available from: https://www.astm.org/e2799-17.html (2022)
- Parker, A. E., et al. Ruggedness and reproducibility of the MBEC biofilm disinfectant efficacy test. Journal of Microbiological Methods. 102, 55-64 (2014).
- Stewart, P. S., Parker, A. E. Measuring antimicrobial efficacy against biofilms: A meta-analysis. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 63 (5), 00020 (2019).
- Lindsay, D. K., Fouhy, K., Loh, M., Malakar, P. The CDC biofilm bioreactor is a suitable method to grow biofilms, and test their sanitiser susceptibilities, in the dairy context. International Dairy Journal. 126, 105264 (2022).
- Buckingham-Meyer, K., Goeres, D. M., Hamilton, M. A. Comparative evaluation of biofilm disinfectant efficacy tests. Journal of Microbiological Methods. 70 (2), 236-244 (2007).
- Goeres, D. M., et al. Statistical assessment of a laboratory method for growing biofilms. Microbiology (Reading). 151, 757-762 (2005).
- Williams, D. L., Woodbury, K. L., Haymond, B. S., Parker, A. E., Bloebaum, R. D. A modified CDC biofilm reactor to produce mature biofilms on the surface of peek membranes for an in vivo animal model application. Current Microbiology. 62 (6), 1657-1663 (2011).
- Pieranski, M. K., Rychlowski, M., Grinholc, M. Optimization of Streptococcus agalactiae biofilm culture in a continuous flow system for photoinactivation studies. Pathogens. 10 (9), 1212 (2021).
- Mendez, E., Walker, D. K., Vipham, J., Trinetta, V. The use of a CDC biofilm reactor to grow multi-strain Listeria monocytogenes biofilm. Food Microbiology. 92, 103592 (2020).
- Salgar-Chaparro, S. J., Lepkova, K., Pojtanabuntoeng, T., Darwin, A., Machuca, L. L. Nutrient level determines biofilm characteristics and subsequent impact on microbial corrosion and biocide effectiveness. Applied and Environmental Microbiology. 86 (7), 02885 (2020).
- Goeres, D. M., Simoes, M., Borges, A., Chaves Simoes, L., et al. Design and Fabrication of Biofilm Reactors. Recent Trends in Biofilm Science and Technology. , 71-88 (2020).
- Fjeld, C. S., Schüller, R. B. Biofilm formation during hexadecane degradation and the effects of flow field and shear stresses. Annual Transactions – The Nordic Rheology Society. 21, 341-346 (2013).
- Gilmore, B. F., Hamill, T. M., Jones, D. S., Gorman, S. P. Validation of the CDC biofilm reactor as a dynamic model for assessment of encrustation formation on urological device materials. Journal of Biomedical Materials Research Part B: Applied Biomaterials. 93 (1), 128-140 (2010).
- Picioreanu, C., van Loosdrecht, M. C., Heijnen, J. J. Two-dimensional model of biofilm detachment caused by internal stress from liquid flow. Biotechnology and Bioengineering. 72 (2), 205-218 (2001).
