Rezeke Edilen İnsan Tümör Örneklerinden Ex Vivo Organotipik Psödomiksoma Peritonei Tümör Dilimlerinin Kültürü ve Görüntülenmesi
Summary
Periton yüzeylerine metastaz yapmış insan kanserlerinin üretimi, kültürü ve görselleştirilmesi için bir protokol tanımlıyoruz. Rezeke edilen tümör örnekleri bir vibratom kullanılarak kesilir ve oksijenasyon ve canlılığın artması için geçirgen ekler üzerinde kültürlenir, ardından konfokal mikroskopi ve akış sitometrisi kullanılarak görüntüleme ve aşağı akış analizleri yapılır.
Abstract
Psödomiksoma peritonei (PMP), müsinöz primer tümörün yayılması ve bunun sonucunda periton boşluğunda müsin salgılayan tümör hücrelerinin birikmesi sonucu ortaya çıkan nadir bir durumdur. PMP, apendiks, yumurtalık ve kolorektal dahil olmak üzere çeşitli kanser türlerinden kaynaklanabilir, ancak apendiks neoplazmları en yaygın etiyolojidir. PMP’nin (1) nadirliği, (2) sınırlı murin modelleri ve (3) müsinöz, asellüler histolojisi nedeniyle incelenmesi zordur. Burada sunulan yöntem, tümör mikroçevresinin (TME) bozulmadan kaldığı bir preparatta hasta kaynaklı ex vivo organotipik dilimler kullanılarak bu tümör tiplerinin gerçek zamanlı olarak görselleştirilmesine ve sorgulanmasına izin verir. Bu protokolde, ilk önce bir vibratom ve ardından uzun süreli kültür kullanarak tümör dilimlerinin hazırlanmasını tarif ediyoruz. İkincisi, tümör dilimlerinin konfokal görüntülemesini ve canlılık, kalsiyum görüntüleme ve lokal proliferasyonun fonksiyonel okumalarının nasıl izleneceğini açıklıyoruz. Kısacası, dilimler görüntüleme boyaları ile yüklenir ve konfokal mikroskop üzerine monte edilebilen bir görüntüleme odasına yerleştirilir. Hızlandırılmış videolar ve konfokal görüntüler, ilk canlılığı ve hücresel işlevselliği değerlendirmek için kullanılır. Bu prosedür aynı zamanda TME’deki translasyonel hücresel hareketi ve parakrin sinyal etkileşimlerini de araştırır. Son olarak, akış sitometri analizi için kullanılacak tümör dilimleri için bir ayrışma protokolünü tanımladık. Kantitatif akış sitometri analizi, bağışıklık manzarasında ve epitel hücre içeriğinde meydana gelen değişiklikleri belirlemek için tezgahtan başucuna terapötik testler için kullanılabilir.
Introduction
Psödomiksoma peritonei (PMP), yılda 1 milyon kişi başına 1 insidans oranı ile nadir görülen bir sendromdur. PMP vakalarının çoğu apendiks neoplazmlarından metastazlardan kaynaklanır. Farelerin insan benzeri bir eki olmadığı göz önüne alındığında, bu tür kanserlerin modellenmesi son derece zor olmaya devam etmektedir. Primer hastalık sıklıkla cerrahi rezeksiyon ile tedavi edilebilirken, metastatik hastalık için tedavi seçenekleri sınırlıdır. Bu nedenle, bu yeni organotipik dilim modelini geliştirmenin mantığı, PMP’nin patobiyolojisini incelemektir. Bugüne kadar, sürekli olarak kültürlenebilecek apendiks organoid modelleri yoktur; Bununla birlikte, yeni bir modelin terapötik ajanların farmakolojik testleri ve immünoterapi2 için yararlı olduğu gösterilmiştir. Bu nedenle, beyin, meme, pankreas, akciğer, yumurtalık ve diğerleri gibi diğer insan kanseri türlerinde kullanılan organotipik bir dilim kültür sistemini uyarladık 3,4,5,6.
Apendiks neoplazmlarına ek olarak, PMP bazen yumurtalık kanserleri7 ve nadir durumlarda intraduktal papiller müsinöz neoplazmlar8 ve kolon kanseri9 dahil olmak üzere diğer tümör tiplerinden kaynaklanır. Ek olarak, bu tümörler yavaş büyüme eğilimindedir, hasta kaynaklı ksenogreft (PDX) modellerinde zayıf engraft oranları10,11. Bu zorluklar göz önüne alındığında, PMP’nin patobiyolojisini ve bu kanser hücrelerinin periton yüzeylerine nasıl alındığını, çoğaldığını ve bağışıklık gözetiminden nasıl kaçtığını anlamaya başlamak için bu hastalığı incelemek için modeller geliştirmek için karşılanmamış bir ihtiyaç vardır.
Sistemik vasküler dolaşımdan kesilirken, tümör dilimleri hücre dışı matriks, stromal hücreler, bağışıklık hücreleri, kanser hücreleri, endotel hücreleri ve sinirler dahil olmak üzere hücresel ve asellüler bileşenler içerir. Bu yarı bozulmamış mikro ortam, sadece kanser hücrelerinden oluşan 3D organoid kültürlere kıyasla benzersiz bir şekilde avantajlı olan bu hücre tiplerinin işlevsel olarak araştırılmasına izin verir12. Organotipik dilim kültürleri bazı açılardan avantajlı olsa da, genişletilebilen 3D organoidlere kıyasla doğal olarak düşük verime dayalı bir yaklaşımdır ve çok katlı araştırma terapötik ilaç taraması için uygundur13,14,15. PMP durumunda, PMP türevi organoidlerin güvenilir bir şekilde kurulduğunu ve sürekli olarak geçtiğini belgeleyen hiçbir rapor bulunmamaktadır16. Bu muhtemelen PMP kaynaklı tümör hücrelerinin yavaş büyüyen doğasının yanı sıra bu müsinöz tümörlerde bulunan düşük sayıda malign epitel hücresinden kaynaklanmaktadır. PMP’yi incelemek için modeller geliştirme ihtiyacı göz önüne alındığında, organotipik dilimler bu hastalığı incelemek için benzersiz bir şekilde uygundur. İnsan örneklerinden PMP’nin hazırlanması, görüntülenmesi ve analiz edilmesi için bir protokol sunuyoruz.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu makalede, insan psödomiksoma peritonei (PMP) tümör örneklerini kültürlemek, sorgulamak ve analiz etmek için kullanılabilecek bir teknik açıklanmaktadır. Tümör immün mikro çevresini sorgulamak için çok sayıda aşağı akış fonksiyonel tahlili ve tezgahtan başucu testi için bir platform kullandık.
Yöntem ellerimizde oldukça verimli olsa da, bir vibratom kullanarak tümör örneklerini kesmek için biraz pratik gerektirecektir. Yani, yüksek derecede müsinöz örnekle…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Yazarlar, UCSD İhtisas Kanser Destek Merkezi P30 hibesi 2P30CA023100 mikroskoplarıyla ilgili yardım için Moores Kanser Merkezi görüntüleme çekirdek tesisinden Kersi Pestonjamasp’a teşekkür etmek istiyor. Bu çalışma ayrıca bir JoVE yayın hibesi (JRW) ve Elisabeth ve Ad Creemers, Euske Aile Vakfı, Gastrointestinal Kanser Araştırma Fonu ve Peritoneal Metastaz Araştırma Fonu (AML) mülklerinden cömert hediyeler ile desteklenmiştir.
Materials
| 1 M CaCl2 solution | Sigma | 21115 | |
| 1 M HEPES solution | Sigma | H0887 | |
| 1 M MgCl2 solution | Sigma | M1028 | |
| 100 micron filter | ThermoFisher | 22-363-549 | |
| 22 x 40 glass coverslips | Daiggerbrand | G15972H | |
| 3 M KCl solution | Sigma | 60135 | |
| 5 M NaCl solution | Sigma | S5150 | |
| ATPγS | Tocris | 4080 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| Calcein-AM | Invitrogen | L3224 | |
| CD11b | Biolegend | 101228 | |
| CD206 | Biolegend | 321140 | |
| CD3 | Biolegend | 555333 | |
| CD4 | Biolegend | 357410 | |
| CD45 | Biolegend | 304006 | |
| CD8 | Biolegend | 344721 | |
| CellTiter-Glo | Promega | G9681 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11965084 | |
| DPBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| FBS, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| Fc-block | BD Biosciences | 564220 | |
| Fluo-4 | Thermo Fisher | F14201 | |
| Gentle Collagenase/Hyaluronidase | Stem Cell | 7912 | |
| Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Imaging Chamber Platform | Warner Instruments | PH-1 | |
| LD-Blue | Biolegend | L23105 | |
| L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher | 25030081 | |
| LIVE/DEAD imaging dyes | Thermofisher | R37601 | |
| Nikon Ti microscope | Nikon | Includes: A1R hybrid confocal scanner including a high-resolution (4096×4096) scanner, LU4 four-laser AOTF unit with 405, 488, 561, and 647 lasers, Plan Apo 10 (NA 0.8), 20X (NA 0.9) dry objectives. | |
| Peristaltic pump | Isamtec | ISM832C | |
| Propidium Iodide | Invitrogen | L3224 | |
| Vacuum silicone grease | Sigma | Z273554-1EA |
Referências
- Bevan, K. E., Mohamed, F., Moran, B. J. Pseudomyxoma peritonei. World Journal of Gastrointestinal Oncology. 2 (1), 44-50 (2010).
- Votanopoulos, K. I., et al. Appendiceal cancer patient-specific tumor organoid model for predicting chemotherapy efficacy prior to initiation of treatment: A feasibility study. Annals of Surgical Oncology. 26 (1), 139-147 (2019).
- Holliday, D. L., et al. The practicalities of using tissue slices as preclinical organotypic breast cancer models. Journal of Clinical Pathology. 66 (3), 253-255 (2013).
- Koerfer, J., et al. Organotypic slice cultures of human gastric and esophagogastric junction cancer. Cancer Medicine. 5 (7), 1444-1453 (2016).
- Misra, S., et al. Ex vivo organotypic culture system of precision-cut slices of human pancreatic ductal adenocarcinoma. Scientific Reports. 9 (1), 2133 (2019).
- Ohnishi, T., Matsumura, H., Izumoto, S., Hiraga, S., Hayakawa, T. A novel model of glioma cell invasion using organotypic brain slice culture. Pesquisa do Câncer. 58 (14), 2935-2940 (1998).
- Seidman, J. D., Elsayed, A. M., Sobin, L. H., Tavassoli, F. A. Association of mucinous tumors of the ovary and appendix. A clinicopathologic study of 25 cases. The Amerian Journal of Surgical Pathology. 17 (1), 22-34 (1993).
- Mizuta, Y., et al. Pseudomyxoma peritonei accompanied by intraductal papillary mucinous neoplasm of the pancreas. Pancreatology. 5 (4-5), 470-474 (2005).
- Gong, Y., Wang, X., Zhu, Z. Pseudomyxoma peritonei originating from transverse colon mucinous adenocarcinoma: A case report and literature review. Gastroenterology Research and Practice. 2020, 5826214 (2020).
- Fleten, K. G., et al. Experimental treatment of mucinous peritoneal metastases using patient-derived xenograft models. Translational Oncology. 13 (8), 100793 (2020).
- Kuracha, M. R., Thomas, P., Loggie, B. W., Govindarajan, V. Patient-derived xenograft mouse models of pseudomyxoma peritonei recapitulate the human inflammatory tumor microenvironment. Cancer Medicine. 5 (4), 711-719 (2016).
- Jiang, X., et al. Long-lived pancreatic ductal adenocarcinoma slice cultures enable precise study of the immune microenvironment. Oncoimmunology. 6 (7), 1333210 (2017).
- Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS. Drug Discovery Today. 10 (14), 993-1000 (2005).
- Liu, L., Yu, L., Li, Z., Li, W., Huang, W. Patient-derived organoid (PDO) platforms to facilitate clinical decision making. Journal of Translational Medicine. 19 (1), 40 (2021).
- Croft, C. L., Futch, H. S., Moore, B. D., Golde, T. E. Organotypic brain slice cultures to model neurodegenerative proteinopathies. Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 45 (2019).
- Carr, N. J. New insights in the pathology of peritoneal surface malignancy. Journal of Gastrointestinal Oncology. 12, 216-229 (2021).
- Votanopoulos, K. I., et al. Outcomes of repeat cytoreductive surgery with hyperthermic intraperitoneal chemotherapy for the treatment of peritoneal surface malignancy. Journal of the American College of Surgeons. 215 (3), 412-417 (2012).
- Weitz, J., et al. An ex-vivo organotypic culture platform for functional interrogation of human appendiceal cancer reveals a prominent and heterogenous immunological landscape. Clinical Cancer Research. 28 (21), 4793-4806 (2022).
- Pitoulis, F. G., Watson, S. A., Perbellini, F., Terracciano, C. M. Myocardial slices come to age: an intermediate complexity in vitro cardiac model for translational research. Cardiovascular Research. 116 (7), 1275-1287 (2020).
- Habeler, W., Peschanski, M., Monville, C. Organotypic heart slices for cell transplantation and physiological studies. Organogenesis. 5 (2), 62-66 (2009).
