Vi beskriver en protokol for produktion, kultur og visualisering af humane kræftformer, som har metastaseret til peritoneale overflader. Resected tumorprøver skæres ved hjælp af et vibratomt og dyrkes på permeable indsatser for øget iltning og levedygtighed, efterfulgt af billeddannelse og nedstrømsanalyser ved hjælp af konfokal mikroskopi og flowcytometri.
Pseudomyxoma peritonei (PMP) er en sjælden tilstand, der skyldes spredning af en mucinøs primær tumor og den resulterende ophobning af mucinudskillende tumorceller i bughulen. PMP kan opstå fra forskellige typer kræftformer, herunder appendiceal, ovarie og kolorektal, selvom appendiceal neoplasmer er langt den mest almindelige ætiologi. PMP er udfordrende at studere på grund af dets (1) sjældenhed, (2) begrænsede murinmodeller og (3) mucinøs, acellulær histologi. Metoden, der præsenteres her, tillader visualisering og forhør i realtid af disse tumortyper ved hjælp af patientafledte ex vivo organotypiske skiver i et præparat, hvor tumormikromiljøet (TME) forbliver intakt. I denne protokol beskriver vi først forberedelsen af tumorskiver ved hjælp af et vibratomt og efterfølgende langsigtet kultur. For det andet beskriver vi konfokal billeddannelse af tumorskiver og hvordan man overvåger funktionelle aflæsninger af levedygtighed, calciumbilleddannelse og lokal spredning. Kort sagt er skiver fyldt med billedfarvestoffer og placeres i et billeddannelseskammer, der kan monteres på et konfokalmikroskop. Time-lapse-videoer og konfokale billeder bruges til at vurdere den oprindelige levedygtighed og cellulære funktionalitet. Denne procedure undersøger også translationel cellulær bevægelse og parakrin signalinteraktion i TME. Endelig beskriver vi en dissociationsprotokol for tumorskiver, der skal bruges til flowcytometrianalyse. Kvantitativ flowcytometrianalyse kan anvendes til terapeutisk test fra bænk til seng for at bestemme ændringer, der forekommer i immunlandskabet og epitelcelleindholdet.
Pseudomyxoma peritonei (PMP) er sjældent syndrom med en forekomst på 1 pr. Million mennesker om året1. De fleste PMP-tilfælde er forårsaget af metastaser fra appendiceale neoplasmer. I betragtning af at mus ikke har et menneskelignende appendiks, er modellering af denne type kræft fortsat ekstremt udfordrende. Mens den primære sygdom ofte kan helbredes ved kirurgisk resektion, er behandlingsmulighederne for metastatisk sygdom begrænsede. Derfor er begrundelsen for at udvikle denne nye organotypiske skivemodel at studere patobiologien af PMP. Til dato er der ingen appendiceal organoidmodeller, der kan dyrkes evigt; Imidlertid viste en nylig model sig at være nyttig til farmakologisk test af terapeutiske midler og immunterapi2. Som sådan har vi tilpasset et organotypisk skivekultursystem, som er blevet brugt i andre typer humane kræftformer, såsom hjerne, bryst, bugspytkirtel, lunge, æggestokke og andre 3,4,5,6.
Ud over appendiceal neoplasmer skyldes PMP lejlighedsvis andre tumortyper, herunder kræft i æggestokkene7, og i sjældne tilfælde intraduktale papillære mucinøse neoplasmer8 og tyktarmskræft9. Derudover har disse tumorer tendens til at vokse langsomt med dårlige engrafthastigheder i patientafledte xenograft (PDX) modeller10,11. I betragtning af disse udfordringer er der et uopfyldt behov for at udvikle modeller til at studere denne sygdom for at begynde at forstå patobiologien af PMP, og hvordan disse kræftceller: rekrutteres til peritoneale overflader, spredes og undslipper immunovervågning.
Mens skåret fra den systemiske vaskulære cirkulation, tumorskiver indeholder cellulære og acellulære komponenter, herunder den ekstracellulære matrix, stromale celler, immunceller, kræftceller, endotelceller og nerver. Dette semi-intakte mikromiljø giver mulighed for funktionel undersøgelse af disse celletyper, hvilket er unikt fordelagtigt sammenlignet med 3D-organoidkulturer, som kun består af kræftceller12. Mens organotypiske skivekulturer er fordelagtige i nogle henseender, er de også i sagens natur en tilgang med lav gennemstrømning sammenlignet med 3D-organoider, som kan udvides og er egnede til multiplekset terapeutisk forsøgslægemiddelscreening13,14,15. I tilfældet PMP har der ikke været rapporter, der dokumenterer pålidelig etablering og evig overførsel af PMP-afledte organoider16. Dette skyldes sandsynligvis den langsomt voksende karakter af PMP-afledte tumorceller samt det lave antal maligne epitelceller, der findes inden for disse mucinøse tumorer. I betragtning af behovet for at udvikle modeller til undersøgelse af PMP er organotypiske skiver unikt egnet til at studere denne sygdom. Vi præsenterer en protokol til forberedelse, billeddannelse og analyse af PMP fra humane prøver.
Dette manuskript beskriver en teknik, der kan bruges til at dyrke, forhøre og analysere humane pseudomyxoma peritonei (PMP) tumorprøver. Vi har brugt adskillige downstream funktionelle assays til at forhøre tumorimmunmikromiljøet og en platform til bench-to-bedside test.
Mens metoden er yderst effektiv i vores hænder, vil det kræve en vis øvelse at skære tumorprøver ved hjælp af et vibraatom. Vi stødte nemlig på problemer, der skyldtes meget mucinøse prøver, samt prøver, der fej…
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke Kersi Pestonjamasp fra Moores Cancer Center imaging kernefacilitet for hjælp med mikroskoperne UCSD Specialized Cancer Support Center P30 tilskud 2P30CA023100. Dette arbejde blev desuden støttet af et JoVE-publikationstilskud (JRW) samt generøse gaver fra boet efter Elisabeth og Ad Creemers, Euske Family Foundation, Gastrointestinal Cancer Research Fund og Peritoneal Metastasis Research Fund (AML).
1 M CaCl2 solution | Sigma | 21115 | |
1 M HEPES solution | Sigma | H0887 | |
1 M MgCl2 solution | Sigma | M1028 | |
100 micron filter | ThermoFisher | 22-363-549 | |
22 x 40 glass coverslips | Daiggerbrand | G15972H | |
3 M KCl solution | Sigma | 60135 | |
5 M NaCl solution | Sigma | S5150 | |
ATPγS | Tocris | 4080 | |
Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
Calcein-AM | Invitrogen | L3224 | |
CD11b | Biolegend | 101228 | |
CD206 | Biolegend | 321140 | |
CD3 | Biolegend | 555333 | |
CD4 | Biolegend | 357410 | |
CD45 | Biolegend | 304006 | |
CD8 | Biolegend | 344721 | |
CellTiter-Glo | Promega | G9681 | |
DMEM | Thermo Fisher | 11965084 | |
DPBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
FBS, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
Fc-block | BD Biosciences | 564220 | |
Fluo-4 | Thermo Fisher | F14201 | |
Gentle Collagenase/Hyaluronidase | Stem Cell | 7912 | |
Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
Imaging Chamber Platform | Warner Instruments | PH-1 | |
LD-Blue | Biolegend | L23105 | |
L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher | 25030081 | |
LIVE/DEAD imaging dyes | Thermofisher | R37601 | |
Nikon Ti microscope | Nikon | Includes: A1R hybrid confocal scanner including a high-resolution (4096×4096) scanner, LU4 four-laser AOTF unit with 405, 488, 561, and 647 lasers, Plan Apo 10 (NA 0.8), 20X (NA 0.9) dry objectives. | |
Peristaltic pump | Isamtec | ISM832C | |
Propidium Iodide | Invitrogen | L3224 | |
Vacuum silicone grease | Sigma | Z273554-1EA |