Culture et imagerie de tranches tumorales organotypiques ex vivo de pseudomyxomes péritonei à partir de spécimens tumoraux humains réséqués

Summary

Nous décrivons un protocole pour la production, la culture et la visualisation des cancers humains, qui ont métastasé aux surfaces péritonéales. Les échantillons tumoraux réséqués sont coupés à l’aide d’un vibratome et cultivés sur des inserts perméables pour une oxygénation et une viabilité accrues, suivis d’une imagerie et d’analyses en aval utilisant la microscopie confocale et la cytométrie en flux.

Abstract

Le pseudomyxome peritonei (PMP) est une maladie rare qui résulte de la dissémination d’une tumeur primaire mucineuse et de l’accumulation résultante de cellules tumorales sécrétant de la mucine dans la cavité péritonéale. La PMP peut provenir de divers types de cancers, y compris l’appendice, l’ovaire et le colorectal, bien que les néoplasmes de l’appendice soient de loin l’étiologie la plus courante. La PMP est difficile à étudier en raison de (1) sa rareté, (2) ses modèles murins limités et (3) son histologie acellulaire mucineuse. La méthode présentée ici permet de visualiser et d’interroger en temps réel ces types de tumeurs à l’aide de tranches organotypiques ex vivo dérivées du patient dans une préparation où le microenvironnement tumoral (TME) reste intact. Dans ce protocole, nous décrivons d’abord la préparation de tranches tumorales à l’aide d’un vibratome et la culture ultérieure à long terme. Deuxièmement, nous décrivons l’imagerie confocale des tranches tumorales et comment surveiller les lectures fonctionnelles de la viabilité, de l’imagerie calcique et de la prolifération locale. En bref, les tranches sont chargées de colorants d’imagerie et sont placées dans une chambre d’imagerie qui peut être montée sur un microscope confocal. Des vidéos accélérées et des images confocales sont utilisées pour évaluer la viabilité initiale et la fonctionnalité cellulaire. Cette procédure explore également le mouvement cellulaire translationnel et les interactions de signalisation paracrine dans le TME. Enfin, nous décrivons un protocole de dissociation pour les tranches tumorales à utiliser pour l’analyse de cytométrie en flux. L’analyse quantitative par cytométrie en flux peut être utilisée pour les tests thérapeutiques du laboratoire au chevet du patient afin de déterminer les changements qui se produisent dans le paysage immunitaire et le contenu des cellules épithéliales.

Introduction

Le pseudomyxome péritonique (PMP) est un syndrome rare avec un taux d’incidence de 1 par million de personnes par an¹. La plupart des cas de PMP sont causés par des métastases de néoplasmes appendiceux. Étant donné que les souris n’ont pas d’appendice semblable à celui de l’homme, la modélisation de ce type de cancer reste extrêmement difficile. Bien que la maladie primaire soit souvent curable par résection chirurgicale, les options de traitement de la maladie métastatique sont limitées. Par conséquent, la raison d’être du développement de ce nouveau modèle de tranches organotypiques est d’étudier la pathobiologie de PMP. À ce jour, il n’existe aucun modèle organoïde appendice pouvant être cultivé perpétuellement; Cependant, un modèle récent s’est révélé utile pour les tests pharmacologiques d’agents thérapeutiques et d’immunothérapie². En tant que tel, nous avons adapté un système de culture de tranches organotypiques, qui a été utilisé dans d’autres types de cancers humains, tels que le cerveau, le sein, le pancréas, le poumon, l’ovaire et d’autres 3,4,5,6.

En plus des néoplasmes annexes, la PMP résulte occasionnellement d’autres types de tumeurs, notamment les cancers de l’ovaire⁷ et, dans de rares circonstances, les tumeurs mucineuses papillaires intracanalaires⁸ et le cancer du côlon⁹. De plus, ces tumeurs ont tendance à croître lentement, avec de faibles taux de greffe dans les modèles de xénogreffe dérivée du patient (PDX)^10,11. Compte tenu de ces défis, il existe un besoin non satisfait de développer des modèles pour étudier cette maladie afin de commencer à comprendre la pathobiologie de la PMP et comment ces cellules cancéreuses sont recrutées sur les surfaces péritonéales, prolifèrent et échappent à la surveillance immunitaire.

Bien que coupées de la circulation vasculaire systémique, les tranches tumorales contiennent des composants cellulaires et acellulaires, y compris la matrice extracellulaire, les cellules stromales, les cellules immunitaires, les cellules cancéreuses, les cellules endothéliales et les nerfs. Ce microenvironnement semi-intact permet l’investigation fonctionnelle de ces types cellulaires, ce qui est particulièrement avantageux par rapport aux cultures organoïdes 3D, qui ne sont constituées que de cellules cancéreuses¹². Bien que les cultures de tranches organotypiques soient avantageuses à certains égards, elles constituent également une approche intrinsèquement basée sur le faible débit, par rapport aux organoïdes 3D, qui peuvent être étendus et conviennent au criblage multiplexé de médicaments thérapeutiques expérimentaux^13,14,15. Dans le cas du PMP, il n’y a eu aucun rapport documentant l’établissement fiable et le passage perpétuel d’organoïdes dérivés du PMP¹⁶. Cela est probablement dû à la nature à croissance lente des cellules tumorales dérivées de la PMP, ainsi qu’au faible nombre de cellules épithéliales malignes trouvées dans ces tumeurs mucineuses. Compte tenu de la nécessité de développer des modèles pour étudier la PMP, les tranches organotypiques sont particulièrement adaptées à l’étude de cette maladie. Nous présentons un protocole de préparation, d’imagerie et d’analyse des PMP à partir de spécimens humains.

Protocol

La désidentification et l’acquisition de tous les tissus ont été effectuées selon un protocole approuvé par l’IRB à l’Université de Californie à San Diego. 1. Préparation de tissus PMP humains pour le traitement et la culture de tissus Transport des tissus tumoraux et microdissectionPréparer les milieux de transport et de culture : compléter 10 % (v/v) de milieux Eagle modifiés de Dulbecco (DMEM), 10 % FBS, 2 mM L-glutamine, 1 % Pénicilline…

Representative Results

En bref, les échantillons de tumeurs humaines provenant du PMP sont obtenus dans le cadre d’un protocole approuvé par l’IRB. Le tissu est préparé, microdisséqué et solidifié dans un moule en agarose pour être coupé à l’aide d’un vibratome (figure 1A; Vidéo 1). Une fois coupées, les tranches de tissu sont placées et cultivées sur des membranes d’insertion perméables (Figure 1B), qui peuvent être utilisées pour des essai…

Discussion

Ce manuscrit décrit une technique qui peut être utilisée pour cultiver, interroger et analyser des échantillons tumoraux humains de pseudomyxome péritoné (PMP). Nous avons utilisé de nombreux tests fonctionnels en aval pour interroger le microenvironnement immunitaire tumoral et une plate-forme pour les tests du laboratoire au chevet du patient.

Bien que la méthode soit très efficace entre nos mains, il faudra un peu de pratique pour couper des échantillons tumoraux à l’aide d’u…

Materials

1 M CaCl2 solution	Sigma	21115
1 M HEPES solution	Sigma	H0887
1 M MgCl2 solution	Sigma	M1028
100 micron filter	ThermoFisher	22-363-549
22 x 40 glass coverslips	Daiggerbrand	G15972H
3 M KCl solution	Sigma	60135
5 M NaCl solution	Sigma	S5150
ATPγS	Tocris	4080
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153
Calcein-AM	Invitrogen	L3224
CD11b	Biolegend	101228
CD206	Biolegend	321140
CD3	Biolegend	555333
CD4	Biolegend	357410
CD45	Biolegend	304006
CD8	Biolegend	344721
CellTiter-Glo	Promega	G9681
DMEM	Thermo Fisher	11965084
DPBS	Sigma Aldrich	D8537
FBS, heat inactivated	ThermoFisher	16140071
Fc-block	BD Biosciences	564220
Fluo-4	Thermo Fisher	F14201
Gentle Collagenase/Hyaluronidase	Stem Cell	7912
Imaging Chamber	Warner Instruments	RC-26
Imaging Chamber Platform	Warner Instruments	PH-1
LD-Blue	Biolegend	L23105
L-Glutamine 200 mM	ThermoFisher	25030081
LIVE/DEAD imaging dyes	Thermofisher	R37601
Nikon Ti microscope	Nikon		Includes: A1R hybrid confocal scanner including a high-resolution (4096×4096) scanner, LU4 four-laser AOTF unit with 405, 488, 561, and 647 lasers, Plan Apo 10 (NA 0.8), 20X (NA 0.9) dry objectives.
Peristaltic pump	Isamtec	ISM832C
Propidium Iodide	Invitrogen	L3224
Vacuum silicone grease	Sigma	Z273554-1EA