Kultivierung und Bildgebung von ex vivo organotypischen Pseudomyxoma-Peritonei-Tumorschnitten aus resezierten humanen Tumorproben
Summary
Wir beschreiben ein Protokoll für die Herstellung, Kultivierung und Visualisierung von menschlichen Krebserkrankungen, die Metastasen in die Peritonealoberflächen gebildet haben. Resezierte Tumorproben werden mit einem Vibratom geschnitten und auf permeablen Einsätzen kultiviert, um die Sauerstoffversorgung und Viabilität zu erhöhen, gefolgt von Bildgebung und nachgeschalteten Analysen mittels konfokaler Mikroskopie und Durchflusszytometrie.
Abstract
Das Pseudomyxoma peritonei (PMP) ist eine seltene Erkrankung, die durch die Ausbreitung eines muzinösen Primärtumors und die daraus resultierende Ansammlung von Muzin-sezernierenden Tumorzellen in der Bauchhöhle entsteht. PMP kann durch verschiedene Arten von Krebs entstehen, einschließlich Blinddarmkrebs, Eierstockkrebs und Darmkrebs, obwohl Blinddarmtumoren bei weitem die häufigste Ätiologie sind. PMP ist aufgrund seiner (1) Seltenheit, (2) begrenzten Mausmodellen und (3) muzinöser, azellulärer Histologie schwierig zu untersuchen. Die hier vorgestellte Methode ermöglicht die Echtzeit-Visualisierung und -Abfrage dieser Tumorarten unter Verwendung von patienteneigenen ex vivo organotypischen Schnitten in einem Präparat, bei dem die Tumormikroumgebung (TME) intakt bleibt. In diesem Protokoll beschreiben wir zunächst die Präparation von Tumorschnitten mit einem Vibratom und die anschließende Langzeitkultur. Zweitens beschreiben wir die konfokale Bildgebung von Tumorschnitten und wie funktionelle Messwerte der Viabilität, der Kalziumbildgebung und der lokalen Proliferation überwacht werden können. Kurz gesagt, die Schichten werden mit bildgebenden Farbstoffen beladen und in eine Bildgebungskammer gelegt, die auf ein konfokales Mikroskop montiert werden kann. Zeitraffervideos und konfokale Bilder werden verwendet, um die anfängliche Lebensfähigkeit und zelluläre Funktionalität zu beurteilen. Dieses Verfahren untersucht auch die translationale zelluläre Bewegung und parakrine Signalinteraktionen im TME. Abschließend beschreiben wir ein Dissoziationsprotokoll für Tumorschnitte, die für die durchflusszytometrische Analyse verwendet werden sollen. Die quantitative Durchflusszytometrie kann für therapeutische Tests vom Labor bis zum Krankenbett verwendet werden, um Veränderungen innerhalb der Immunlandschaft und des Epithelzellgehalts zu bestimmen.
Introduction
Das Pseudomyxoma peritonei (PMP) ist ein seltenes Syndrom mit einer Inzidenzrate von 1 pro Million Menschen und Jahr1. Die meisten PMP-Fälle werden durch Metastasen aus Blinddarmneoplasien verursacht. Da Mäuse keinen menschenähnlichen Blinddarm haben, bleibt die Modellierung dieser Krebsart eine große Herausforderung. Während die Grunderkrankung oft durch eine chirurgische Resektion heilbar ist, sind die Behandlungsmöglichkeiten bei metastasierten Erkrankungen begrenzt. Daher ist die Begründung für die Entwicklung dieses neuartigen organotypischen Schnittmodells die Untersuchung der Pathobiologie von PMP. Bis heute gibt es keine Appendiceal-Organoid-Modelle, die dauerhaft kultiviert werden können. Ein aktuelles Modell hat sich jedoch als nützlich für die pharmakologische Testung von Therapeutika und Immuntherapie erwiesen2. Aus diesem Grund haben wir ein organotypisches Schnittkultursystem angepasst, das bereits bei anderen Krebsarten des Menschen eingesetzt wurde, wie z. B. Gehirn-, Brust-, Bauchspeicheldrüsen-, Lungen-, Eierstockkrebs und anderen 3,4,5,6.
Neben Appendiceal-Neoplasien resultiert PMP gelegentlich auch aus anderen Tumorarten, darunter Ovarialkarzinome7 und in seltenen Fällen intraduktale papilläre muzinöse Neoplasien8 und Kolonkarzinom9. Darüber hinaus neigen diese Tumoren dazu, langsam zu wachsen, mit schlechten Transplantatraten in patientenabgeleiteten Xenograft-Modellen (PDX)10,11. Angesichts dieser Herausforderungen besteht ein ungedeckter Bedarf an der Entwicklung von Modellen zur Untersuchung dieser Krankheit, um die Pathobiologie von PMP zu verstehen und zu verstehen, wie diese Krebszellen an die Peritonealoberflächen rekrutiert werden, sich vermehren und der Immunüberwachung entkommen.
Während Tumorschnitte aus dem systemischen Gefäßkreislauf geschnitten werden, enthalten sie zelluläre und azelluläre Komponenten, darunter die extrazelluläre Matrix, Stromazellen, Immunzellen, Krebszellen, Endothelzellen und Nerven. Diese semi-intakte Mikroumgebung ermöglicht die funktionelle Untersuchung dieser Zelltypen, was im Vergleich zu 3D-Organoidkulturen, die nur aus Krebszellen bestehen, einen einzigartigen Vorteil hat12. Während organotypische Schnittkulturen in mancher Hinsicht vorteilhaft sind, sind sie im Vergleich zu 3D-Organoiden, die expandiert werden können, auch von Natur aus ein Ansatz mit niedrigem Durchsatz und eignen sich für das Multiplex-Screening therapeutischer Prüfpräparate13,14,15. Im Fall von PMP gibt es keine Berichte, die eine zuverlässige Etablierung und fortwährende Weitergabe von PMP-abgeleiteten Organoiden belegen16. Dies ist wahrscheinlich auf das langsame Wachstum von PMP-abgeleiteten Tumorzellen sowie auf die geringe Anzahl bösartiger Epithelzellen zurückzuführen, die in diesen muzinösen Tumoren zu finden sind. Angesichts der Notwendigkeit, Modelle zur Untersuchung von PMP zu entwickeln, sind organotypische Schnitte besonders gut geeignet, um diese Krankheit zu untersuchen. Wir stellen ein Protokoll zur Präparation, Bildgebung und Analyse von PMP aus menschlichen Proben vor.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dieses Manuskript beschreibt eine Technik, die zur Kultivierung, Abfrage und Analyse von humanen Pseudomyxoma peritonei (PMP)-Tumorproben verwendet werden kann. Wir haben zahlreiche nachgeschaltete funktionelle Assays verwendet, um die Mikroumgebung des Tumorimmunsystems zu untersuchen, und eine Plattform für Tests vom Labor bis zum Krankenbett.
Während die Methode in unseren Händen sehr effizient ist, erfordert es etwas Übung, Tumorproben mit einem Vibratom zu schneiden. Wir stießen näm…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren bedanken sich bei Kersi Pestonjamasp von der Moores Cancer Center Imaging Core Facility für die Hilfe mit dem UCSD Specialized Cancer Support Center P30 Grant 2P30CA023100. Diese Arbeit wurde zusätzlich durch ein JoVE-Publikationsstipendium (JRW) sowie großzügige Schenkungen aus dem Nachlass von Elisabeth und Ad Creemers, der Euske Family Foundation, dem Gastrointestinal Cancer Research Fund und dem Peritoneal Metastasis Research Fund (AML) unterstützt.
Materials
| 1 M CaCl2 solution | Sigma | 21115 | |
| 1 M HEPES solution | Sigma | H0887 | |
| 1 M MgCl2 solution | Sigma | M1028 | |
| 100 micron filter | ThermoFisher | 22-363-549 | |
| 22 x 40 glass coverslips | Daiggerbrand | G15972H | |
| 3 M KCl solution | Sigma | 60135 | |
| 5 M NaCl solution | Sigma | S5150 | |
| ATPγS | Tocris | 4080 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| Calcein-AM | Invitrogen | L3224 | |
| CD11b | Biolegend | 101228 | |
| CD206 | Biolegend | 321140 | |
| CD3 | Biolegend | 555333 | |
| CD4 | Biolegend | 357410 | |
| CD45 | Biolegend | 304006 | |
| CD8 | Biolegend | 344721 | |
| CellTiter-Glo | Promega | G9681 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11965084 | |
| DPBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| FBS, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| Fc-block | BD Biosciences | 564220 | |
| Fluo-4 | Thermo Fisher | F14201 | |
| Gentle Collagenase/Hyaluronidase | Stem Cell | 7912 | |
| Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Imaging Chamber Platform | Warner Instruments | PH-1 | |
| LD-Blue | Biolegend | L23105 | |
| L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher | 25030081 | |
| LIVE/DEAD imaging dyes | Thermofisher | R37601 | |
| Nikon Ti microscope | Nikon | Includes: A1R hybrid confocal scanner including a high-resolution (4096×4096) scanner, LU4 four-laser AOTF unit with 405, 488, 561, and 647 lasers, Plan Apo 10 (NA 0.8), 20X (NA 0.9) dry objectives. | |
| Peristaltic pump | Isamtec | ISM832C | |
| Propidium Iodide | Invitrogen | L3224 | |
| Vacuum silicone grease | Sigma | Z273554-1EA |
Referências
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