תרבית והדמיה של פרוסות גידול Pseudomyxoma peritonei אורגנוטיפיות Ex vivo מדגימות גידול אנושי מנותחות
Summary
אנו מתארים פרוטוקול לייצור, תרבות והדמיה של סוגי סרטן אנושיים, אשר שלחו גרורות למשטחי הצפק. דגימות גידול שנכרתו נחתכות באמצעות ויברטומה ומתורבתות על תוספות חדירות להגברת החמצון והכדאיות, ולאחר מכן הדמיה וניתוח במורד הזרם באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי וציטומטריית זרימה.
Abstract
Pseudomyxoma peritonei (PMP) הוא מצב נדיר הנובע מהפצת גידול ראשוני מוציני והצטברות של תאי גידול מפרישי מוצין בחלל הצפק. PMP יכול לנבוע מסוגים שונים של סרטן, כולל תוספתן, שחלות ומעי גס, אם כי גידולים בתוספתן הם ללא ספק האטיולוגיה הנפוצה ביותר. PMP מאתגר למחקר בשל (1) נדירותו, (2) מודלים מורינים מוגבלים, ו (3) היסטולוגיה mucinous, אצלולרי. השיטה המוצגת כאן מאפשרת הדמיה וחקירה בזמן אמת של סוגי גידולים אלה באמצעות פרוסות אורגנוטיפיות ex vivo שמקורן במטופל בתכשיר שבו מיקרו-סביבה הגידול (TME) נשארת שלמה. בפרוטוקול זה, אנו מתארים תחילה את הכנת פרוסות הגידול באמצעות ויברטומה ולאחר מכן תרבית לטווח ארוך. שנית, אנו מתארים הדמיה קונפוקלית של פרוסות הגידול וכיצד לעקוב אחר קריאות תפקודיות של כדאיות, הדמיית סידן והתפשטות מקומית. בקיצור, הפרוסות עמוסות בצבעי הדמיה ומונחות בתא הדמיה שניתן להרכיבו על מיקרוסקופ קונפוקלי. סרטוני קיטועי זמן ותמונות קונפוקליות משמשים להערכת הכדאיות הראשונית והפונקציונליות הסלולרית. הליך זה בוחן גם תנועה תאית תרגומית, ואינטראקציות איתות פרקריניות ב- TME. לבסוף, אנו מתארים פרוטוקול דיסוציאציה עבור פרוסות גידול שישמשו לניתוח ציטומטריית זרימה. ניתוח ציטומטריית זרימה כמותית יכול לשמש לבדיקות טיפוליות מהספסל למיטה כדי לקבוע שינויים המתרחשים בנוף החיסון ובתכולת תאי האפיתל.
Introduction
Pseudomyxoma peritonei (PMP) היא תסמונת נדירה עם שיעור היארעות של 1 למיליון אנשים בשנה1. רוב מקרי PMP נגרמים על ידי גרורות מ neoplasms appendiceal. בהתחשב בכך שלעכברים אין תוספתן דמוי אדם, מידול סוג זה של סרטן נותר מאתגר ביותר. בעוד המחלה הראשונית ניתנת לעתים קרובות לריפוי על ידי כריתה כירורגית, אפשרויות הטיפול במחלה גרורתית מוגבלות. לכן, הרציונל לפיתוח מודל פרוסה אורגנוטיפית חדשני זה הוא לחקור את הפתולוגיה של PMP. נכון להיום, אין מודלים אורגנואידים נספחים שניתן לתרבית לנצח; עם זאת, מודל עדכני הוכח כשימושי לבדיקות פרמקולוגיות של חומרים טיפוליים ואימונותרפיה2. ככזה, התאמנו מערכת תרבית פרוסה אורגנוטיפית, אשר שימשה בסוגים אחרים של סרטן אנושי, כגון המוח, השד, הלבלב, הריאות, השחלות,ואחרים 3,4,5,6.
בנוסף לגידולים בתוספתן, PMP נובע לעיתים מסוגי גידולים אחרים, כולל סרטן השחלות7, ובנסיבות נדירות, גידולים ריריים פפילריים אינטרדוקטליים8 וסרטן המעי הגס9. בנוסף, גידולים אלה נוטים לגדול לאט, עם שיעורי השתלה נמוכים במודלים שמקורם בחולה xenograft (PDX)10,11. בהתחשב באתגרים אלה, יש צורך בלתי מסופק לפתח מודלים לחקר מחלה זו כדי להתחיל להבין את הפתולוגיה של PMP, וכיצד תאים סרטניים אלה: מגויסים למשטחי הצפק, מתרבים ומתחמקים ממעקב חיסוני.
בעוד פרוסות הגידול נחתכות ממחזור הדם המערכתי, פרוסות הגידול מכילות רכיבים תאיים ואצלולריים, כולל המטריצה החוץ תאית, תאי סטרומה, תאי מערכת החיסון, תאי סרטן, תאי אנדותל ועצבים. מיקרו-סביבה שלמה למחצה זו מאפשרת חקירה פונקציונלית של סוגי תאים אלה, יתרון ייחודי בהשוואה לתרביות אורגנואידים תלת-ממדיות, המורכבות רק מתאים סרטניים12. בעוד תרביות פרוסות אורגנוטיפיות הן יתרון במובנים מסוימים, הן גם מטבען גישה מבוססת תפוקה נמוכה, בהשוואה לאורגנואידים תלת-ממדיים, הניתנים להרחבה, ומתאימים לבדיקת תרופות טיפוליות ניסיוניות מרובות13,14,15. במקרה של PMP, לא היו דיווחים המתעדים ביסוס אמין והעברה מתמדת של אורגנואידים שמקורם ב-PMP16. זה כנראה בגלל אופי הגידול האיטי של תאים סרטניים שמקורם ב- PMP, כמו גם המספר הנמוך של תאי אפיתל ממאירים הנמצאים בתוך גידולים מוציניים אלה. בהתחשב בצורך לפתח מודלים לחקר PMP, פרוסות אורגנוטיפיות מתאימות באופן ייחודי לחקר מחלה זו. אנו מציגים פרוטוקול להכנה, הדמיה וניתוח PMP מדגימות אנושיות.
Protocol
Representative Results
Discussion
כתב יד זה מתאר טכניקה שניתן להשתמש בה כדי לתרבית, לחקור ולנתח דגימות גידול של Pseudomyxoma peritonei (PMP) אנושי. השתמשנו במספר רב של בדיקות תפקודיות במורד הזרם כדי לחקור את המיקרו-סביבה החיסונית של הגידול ופלטפורמה לבדיקות מהספסל למיטה.
בעוד השיטה יעילה מאוד בידינו, זה ידרוש קצת תרגול ל…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים רוצים להודות לקרסי פסטונג’מאספ ממתקן ההדמיה של מרכז הסרטן מורס על העזרה עם מענק המיקרוסקופים UCSD Specialized Cancer Support Center P30 2P30CA023100. עבודה זו נתמכה גם על ידי מענק פרסום JoVE (JRW), כמו גם תרומות נדיבות מעיזבונם של אליזבת ואד קרימרס, קרן משפחת יוסקה, הקרן לחקר סרטן מערכת העיכול והקרן לחקר גרורות הצפק (AML).
Materials
| 1 M CaCl2 solution | Sigma | 21115 | |
| 1 M HEPES solution | Sigma | H0887 | |
| 1 M MgCl2 solution | Sigma | M1028 | |
| 100 micron filter | ThermoFisher | 22-363-549 | |
| 22 x 40 glass coverslips | Daiggerbrand | G15972H | |
| 3 M KCl solution | Sigma | 60135 | |
| 5 M NaCl solution | Sigma | S5150 | |
| ATPγS | Tocris | 4080 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| Calcein-AM | Invitrogen | L3224 | |
| CD11b | Biolegend | 101228 | |
| CD206 | Biolegend | 321140 | |
| CD3 | Biolegend | 555333 | |
| CD4 | Biolegend | 357410 | |
| CD45 | Biolegend | 304006 | |
| CD8 | Biolegend | 344721 | |
| CellTiter-Glo | Promega | G9681 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11965084 | |
| DPBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| FBS, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| Fc-block | BD Biosciences | 564220 | |
| Fluo-4 | Thermo Fisher | F14201 | |
| Gentle Collagenase/Hyaluronidase | Stem Cell | 7912 | |
| Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Imaging Chamber Platform | Warner Instruments | PH-1 | |
| LD-Blue | Biolegend | L23105 | |
| L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher | 25030081 | |
| LIVE/DEAD imaging dyes | Thermofisher | R37601 | |
| Nikon Ti microscope | Nikon | Includes: A1R hybrid confocal scanner including a high-resolution (4096×4096) scanner, LU4 four-laser AOTF unit with 405, 488, 561, and 647 lasers, Plan Apo 10 (NA 0.8), 20X (NA 0.9) dry objectives. | |
| Peristaltic pump | Isamtec | ISM832C | |
| Propidium Iodide | Invitrogen | L3224 | |
| Vacuum silicone grease | Sigma | Z273554-1EA |
Referências
- Bevan, K. E., Mohamed, F., Moran, B. J. Pseudomyxoma peritonei. World Journal of Gastrointestinal Oncology. 2 (1), 44-50 (2010).
- Votanopoulos, K. I., et al. Appendiceal cancer patient-specific tumor organoid model for predicting chemotherapy efficacy prior to initiation of treatment: A feasibility study. Annals of Surgical Oncology. 26 (1), 139-147 (2019).
- Holliday, D. L., et al. The practicalities of using tissue slices as preclinical organotypic breast cancer models. Journal of Clinical Pathology. 66 (3), 253-255 (2013).
- Koerfer, J., et al. Organotypic slice cultures of human gastric and esophagogastric junction cancer. Cancer Medicine. 5 (7), 1444-1453 (2016).
- Misra, S., et al. Ex vivo organotypic culture system of precision-cut slices of human pancreatic ductal adenocarcinoma. Scientific Reports. 9 (1), 2133 (2019).
- Ohnishi, T., Matsumura, H., Izumoto, S., Hiraga, S., Hayakawa, T. A novel model of glioma cell invasion using organotypic brain slice culture. Pesquisa do Câncer. 58 (14), 2935-2940 (1998).
- Seidman, J. D., Elsayed, A. M., Sobin, L. H., Tavassoli, F. A. Association of mucinous tumors of the ovary and appendix. A clinicopathologic study of 25 cases. The Amerian Journal of Surgical Pathology. 17 (1), 22-34 (1993).
- Mizuta, Y., et al. Pseudomyxoma peritonei accompanied by intraductal papillary mucinous neoplasm of the pancreas. Pancreatology. 5 (4-5), 470-474 (2005).
- Gong, Y., Wang, X., Zhu, Z. Pseudomyxoma peritonei originating from transverse colon mucinous adenocarcinoma: A case report and literature review. Gastroenterology Research and Practice. 2020, 5826214 (2020).
- Fleten, K. G., et al. Experimental treatment of mucinous peritoneal metastases using patient-derived xenograft models. Translational Oncology. 13 (8), 100793 (2020).
- Kuracha, M. R., Thomas, P., Loggie, B. W., Govindarajan, V. Patient-derived xenograft mouse models of pseudomyxoma peritonei recapitulate the human inflammatory tumor microenvironment. Cancer Medicine. 5 (4), 711-719 (2016).
- Jiang, X., et al. Long-lived pancreatic ductal adenocarcinoma slice cultures enable precise study of the immune microenvironment. Oncoimmunology. 6 (7), 1333210 (2017).
- Sundstrom, L., Morrison, B., Bradley, M., Pringle, A. Organotypic cultures as tools for functional screening in the CNS. Drug Discovery Today. 10 (14), 993-1000 (2005).
- Liu, L., Yu, L., Li, Z., Li, W., Huang, W. Patient-derived organoid (PDO) platforms to facilitate clinical decision making. Journal of Translational Medicine. 19 (1), 40 (2021).
- Croft, C. L., Futch, H. S., Moore, B. D., Golde, T. E. Organotypic brain slice cultures to model neurodegenerative proteinopathies. Molecular Neurodegeneration. 14 (1), 45 (2019).
- Carr, N. J. New insights in the pathology of peritoneal surface malignancy. Journal of Gastrointestinal Oncology. 12, 216-229 (2021).
- Votanopoulos, K. I., et al. Outcomes of repeat cytoreductive surgery with hyperthermic intraperitoneal chemotherapy for the treatment of peritoneal surface malignancy. Journal of the American College of Surgeons. 215 (3), 412-417 (2012).
- Weitz, J., et al. An ex-vivo organotypic culture platform for functional interrogation of human appendiceal cancer reveals a prominent and heterogenous immunological landscape. Clinical Cancer Research. 28 (21), 4793-4806 (2022).
- Pitoulis, F. G., Watson, S. A., Perbellini, F., Terracciano, C. M. Myocardial slices come to age: an intermediate complexity in vitro cardiac model for translational research. Cardiovascular Research. 116 (7), 1275-1287 (2020).
- Habeler, W., Peschanski, M., Monville, C. Organotypic heart slices for cell transplantation and physiological studies. Organogenesis. 5 (2), 62-66 (2009).
