एक्स विवो ऑर्गेनोटाइपिक स्यूडोमाइक्सोमा पेरिटोनी ट्यूमर स्लाइस की संस्कृति और इमेजिंग मानव ट्यूमर नमूने से
Summary
हम मानव कैंसर के उत्पादन, संस्कृति और विज़ुअलाइज़ेशन के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं, जो पेरिटोनियल सतहों पर मेटास्टेसाइज्ड होते हैं। निकाले गए ट्यूमर के नमूनों को एक वाइब्रेटोम का उपयोग करके काटा जाता है और ऑक्सीजन और व्यवहार्यता में वृद्धि के लिए पारगम्य आवेषण पर सुसंस्कृत किया जाता है, इसके बाद कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी और फ्लो साइटोमेट्री का उपयोग करके इमेजिंग और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण किया जाता है।
Abstract
स्यूडोमाइक्सोमा पेरिटोनी (पीएमपी) एक दुर्लभ स्थिति है जो एक श्लेष्म प्राथमिक ट्यूमर के प्रसार और पेरिटोनियल गुहा में म्यूसिन-स्रावित ट्यूमर कोशिकाओं के परिणामस्वरूप संचय के परिणामस्वरूप होती है। पीएमपी विभिन्न प्रकार के कैंसर से उत्पन्न हो सकता है, जिसमें परिशिष्ट, डिम्बग्रंथि और कोलोरेक्टल शामिल हैं, हालांकि परिशिष्ट नियोप्लाज्म अब तक का सबसे आम एटियलजि है। पीएमपी अपनी (1) दुर्लभता, (2) सीमित मुराइन मॉडल, और (3) श्लेष्म, एककोशिकीय ऊतक विज्ञान के कारण अध्ययन करना चुनौतीपूर्ण है। यहां प्रस्तुत विधि एक तैयारी में रोगी-व्युत्पन्न पूर्व विवो ऑर्गेनोटाइपिक स्लाइस का उपयोग करके इन ट्यूमर प्रकारों के वास्तविक समय के विज़ुअलाइज़ेशन और पूछताछ की अनुमति देती है जहां ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट (टीएमई) बरकरार रहता है। इस प्रोटोकॉल में, हम पहले एक विब्राटोम और बाद में दीर्घकालिक संस्कृति का उपयोग करके ट्यूमर स्लाइस की तैयारी का वर्णन करते हैं। दूसरा, हम ट्यूमर स्लाइस के कॉन्फोकल इमेजिंग का वर्णन करते हैं और व्यवहार्यता, कैल्शियम इमेजिंग और स्थानीय प्रसार के कार्यात्मक रीडआउट की निगरानी कैसे करें। संक्षेप में, स्लाइस इमेजिंग रंगों से भरे होते हैं और एक इमेजिंग कक्ष में रखे जाते हैं जिन्हें कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप पर रखा जा सकता है। प्रारंभिक व्यवहार्यता और सेलुलर कार्यक्षमता का आकलन करने के लिए टाइम-लैप्स वीडियो और कॉन्फोकल छवियों का उपयोग किया जाता है। यह प्रक्रिया टीएमई में ट्रांसलेशनल सेलुलर आंदोलन और पैराक्रिन सिग्नलिंग इंटरैक्शन की भी पड़ताल करती है। अंत में, हम प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण के लिए उपयोग किए जाने वाले ट्यूमर स्लाइस के लिए एक पृथक्करण प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। मात्रात्मक प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण का उपयोग प्रतिरक्षा परिदृश्य और उपकला कोशिका सामग्री के भीतर होने वाले परिवर्तनों को निर्धारित करने के लिए बेंच-टू-बेडसाइड चिकित्सीय परीक्षण के लिए किया जा सकता है।
Introduction
स्यूडोमाइक्सोमा पेरिटोनी (पीएमपी) दुर्लभ सिंड्रोम है जिसमें प्रति वर्ष प्रति मिलियन लोगों पर 1 की घटना दरहोती है। अधिकांश पीएमपी मामले परिशिष्ट नियोप्लाज्म से मेटास्टेस के कारण होते हैं। यह देखते हुए कि चूहों में मानव जैसा अपेंडिक्स नहीं होता है, इस प्रकार के कैंसर का मॉडलिंग बेहद चुनौतीपूर्ण रहता है। जबकि प्राथमिक रोग अक्सर सर्जिकल रिसेक्शन द्वारा इलाज योग्य होता है, मेटास्टैटिक बीमारी के लिए उपचार के विकल्प सीमित होते हैं। इसलिए, इस उपन्यास ऑर्गेनोटाइपिक स्लाइस मॉडल को विकसित करने का तर्क पीएमपी के पैथोबायोलॉजी का अध्ययन करना है। आज तक, कोई परिशिष्ट ऑर्गेनॉइड मॉडल नहीं हैं जिन्हें हमेशा सुसंस्कृत किया जा सकता है; हालांकि, एक हालिया मॉडल को चिकित्सीय एजेंटों और इम्यूनोथेरेपी2 के औषधीय परीक्षण के लिए उपयोगी दिखाया गया था। जैसे, हमने एक ऑर्गेनोटाइपिक स्लाइस कल्चर सिस्टम को अनुकूलित किया है, जिसका उपयोग अन्य प्रकार के मानव कैंसर, जैसे मस्तिष्क, स्तन, अग्न्याशय, फेफड़े, डिम्बग्रंथि और अन्य 3,4,5,6 में किया गया है।
परिशिष्ट नियोप्लाज्म के अलावा, पीएमपी कभी-कभी डिम्बग्रंथि के कैंसर 7 सहित अन्य ट्यूमर प्रकारों से उत्पन्न होताहै, और दुर्लभ परिस्थितियों में, इंट्राडक्टल पैपिलरी म्यूसिनस नियोप्लाज्म8 और कोलन कैंसर9। इसके अतिरिक्त, ये ट्यूमर धीरे-धीरे बढ़ते हैं, रोगी-व्युत्पन्न जेनोग्राफ्ट (पीडीएक्स) मॉडल10,11 में खराब एनग्राफ्ट दर के साथ। इन चुनौतियों को देखते हुए, पीएमपी के पैथोबायोलॉजी को समझना शुरू करने के लिए इस बीमारी का अध्ययन करने के लिए मॉडल विकसित करने की आवश्यकता है, और ये कैंसर कोशिकाएं: पेरिटोनियल सतहों पर कैसे भर्ती की जाती हैं, प्रसार करती हैं, और प्रतिरक्षा निगरानी से बच जाती हैं।
प्रणालीगत संवहनी परिसंचरण से कटते समय, ट्यूमर स्लाइस में सेलुलर और एककोशिकीय घटक होते हैं, जिनमें बाह्य मैट्रिक्स, स्ट्रोमल कोशिकाएं, प्रतिरक्षा कोशिकाएं, कैंसर कोशिकाएं, एंडोथेलियल कोशिकाएं और तंत्रिकाएं शामिल हैं। यह अर्ध-बरकरार माइक्रोएन्वायरमेंट इन सेल प्रकारों की कार्यात्मक जांच के लिए अनुमति देता है, जो 3 डी ऑर्गेनॉइड संस्कृतियों की तुलना में विशिष्ट रूप से फायदेमंद है, जिसमें केवल कैंसर कोशिकाएं12 शामिल हैं। जबकि ऑर्गेनोटाइपिक स्लाइस संस्कृतियां कुछ मामलों में फायदेमंद हैं, वे 3 डी ऑर्गेनोइड्स की तुलना में स्वाभाविक रूप से कम-थ्रूपुट-आधारित दृष्टिकोण भी हैं, जिन्हें विस्तारित किया जा सकता है, और मल्टीप्लेक्स जांच चिकित्सीय दवा स्क्रीनिंग 13,14,15 के लिए उपयुक्त हैं। पीएमपी के मामले में, पीएमपी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड्स16 की विश्वसनीय स्थापना और सतत पारितीकरण का दस्तावेजीकरण करने वाली कोई रिपोर्ट नहीं मिली है। यह पीएमपी-व्युत्पन्न ट्यूमर कोशिकाओं की धीमी गति से बढ़ती प्रकृति के साथ-साथ इन श्लेष्म ट्यूमर के भीतर पाए जाने वाले घातक उपकला कोशिकाओं की कम संख्या के कारण होने की संभावना है। पीएमपी का अध्ययन करने के लिए मॉडल विकसित करने की आवश्यकता को देखते हुए, ऑर्गेनोटाइपिक स्लाइस इस बीमारी का अध्ययन करने के लिए विशिष्ट रूप से अनुकूल हैं। हम मानव नमूनों से पीएमपी तैयार करने, इमेजिंग करने और विश्लेषण करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
यह पांडुलिपि एक ऐसी तकनीक का वर्णन करती है जिसका उपयोग मानव स्यूडोमाइक्सोमा पेरिटोनी (पीएमपी) ट्यूमर नमूनों की संस्कृति, पूछताछ और विश्लेषण के लिए किया जा सकता है। हमने ट्यूमर प्रतिरक्षा माइक्रोएन्व…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखक माइक्रोस्कोप यूसीएसडी विशेष कैंसर सहायता केंद्र पी 30 अनुदान 2पी 30सीए023100 के साथ मदद के लिए मूर्स कैंसर सेंटर इमेजिंग कोर सुविधा से केर्सी पेस्टोनजामास्प को धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को जोवे प्रकाशन अनुदान (जेआरडब्ल्यू) के साथ-साथ एलिजाबेथ और एड क्रेमर्स की संपत्ति, यूस्के फैमिली फाउंडेशन, गैस्ट्रोइंटेस्टाइनल कैंसर रिसर्च फंड और पेरिटोनियल मेटास्टेसिस रिसर्च फंड (एएमएल) से उदार उपहार भी दिए गए थे।
Materials
| 1 M CaCl2 solution | Sigma | 21115 | |
| 1 M HEPES solution | Sigma | H0887 | |
| 1 M MgCl2 solution | Sigma | M1028 | |
| 100 micron filter | ThermoFisher | 22-363-549 | |
| 22 x 40 glass coverslips | Daiggerbrand | G15972H | |
| 3 M KCl solution | Sigma | 60135 | |
| 5 M NaCl solution | Sigma | S5150 | |
| ATPγS | Tocris | 4080 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| Calcein-AM | Invitrogen | L3224 | |
| CD11b | Biolegend | 101228 | |
| CD206 | Biolegend | 321140 | |
| CD3 | Biolegend | 555333 | |
| CD4 | Biolegend | 357410 | |
| CD45 | Biolegend | 304006 | |
| CD8 | Biolegend | 344721 | |
| CellTiter-Glo | Promega | G9681 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11965084 | |
| DPBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| FBS, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| Fc-block | BD Biosciences | 564220 | |
| Fluo-4 | Thermo Fisher | F14201 | |
| Gentle Collagenase/Hyaluronidase | Stem Cell | 7912 | |
| Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Imaging Chamber Platform | Warner Instruments | PH-1 | |
| LD-Blue | Biolegend | L23105 | |
| L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher | 25030081 | |
| LIVE/DEAD imaging dyes | Thermofisher | R37601 | |
| Nikon Ti microscope | Nikon | Includes: A1R hybrid confocal scanner including a high-resolution (4096×4096) scanner, LU4 four-laser AOTF unit with 405, 488, 561, and 647 lasers, Plan Apo 10 (NA 0.8), 20X (NA 0.9) dry objectives. | |
| Peristaltic pump | Isamtec | ISM832C | |
| Propidium Iodide | Invitrogen | L3224 | |
| Vacuum silicone grease | Sigma | Z273554-1EA |
Referências
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