Coltura e imaging di fette tumorali ex vivo di pseudomixoma peritonei organotipico da campioni tumorali umani resecati

Summary

Descriviamo un protocollo per la produzione, la coltura e la visualizzazione dei tumori umani, che hanno metastatizzato alle superfici peritoneali. I campioni tumorali resecati vengono tagliati utilizzando un vibratomo e coltivati su inserti permeabili per una maggiore ossigenazione e vitalità, seguiti da imaging e analisi a valle utilizzando microscopia confocale e citometria a flusso.

Abstract

Lo pseudomixoma peritonei (PMP) è una condizione rara che deriva dalla diffusione di un tumore primario mucinoso e dal conseguente accumulo di cellule tumorali che secernono mucina nella cavità peritoneale. La PMP può derivare da vari tipi di tumori, tra cui appendicolare, ovarico e colon-retto, sebbene le neoplasie appendicolari siano di gran lunga l’eziologia più comune. La PMP è difficile da studiare a causa della sua (1) rarità, (2) modelli murini limitati e (3) istologia mucinosa e acellulare. Il metodo qui presentato consente la visualizzazione e l’interrogazione in tempo reale di questi tipi di tumore utilizzando fette organotipiche ex vivo derivate dal paziente in una preparazione in cui il microambiente tumorale (TME) rimane intatto. In questo protocollo, descriviamo prima la preparazione delle fette tumorali usando un vibratomo e la successiva coltura a lungo termine. In secondo luogo, descriviamo l’imaging confocale delle fette tumorali e come monitorare le letture funzionali della vitalità, l’imaging del calcio e la proliferazione locale. In breve, le fette vengono caricate con coloranti di imaging e vengono poste in una camera di imaging che può essere montata su un microscopio confocale. I video time-lapse e le immagini confocali vengono utilizzati per valutare la fattibilità iniziale e la funzionalità cellulare. Questa procedura esplora anche il movimento cellulare traslazionale e le interazioni di segnalazione paracrina nella TME. Infine, descriviamo un protocollo di dissociazione per fette tumorali da utilizzare per l’analisi della citometria a flusso. L’analisi quantitativa della citometria a flusso può essere utilizzata per test terapeutici da banco a letto per determinare i cambiamenti che si verificano all’interno del panorama immunitario e del contenuto delle cellule epiteliali.

Introduction

Lo pseudomixoma peritonei (PMP) è una sindrome rara con un tasso di incidenza di 1 per milione di persone all’anno¹. La maggior parte dei casi di PMP sono causati da metastasi da neoplasie appendicolari. Dato che i topi non hanno un’appendice simile a quella umana, modellare questo tipo di cancro rimane estremamente impegnativo. Mentre la malattia primaria è spesso curabile con la resezione chirurgica, le opzioni di trattamento per la malattia metastatica sono limitate. Pertanto, il razionale per lo sviluppo di questo nuovo modello di fetta organotipica è quello di studiare la patobiologia della PMP. Ad oggi, non esistono modelli di organoidi appendicolari che possano essere coltivati perpetuamente; Tuttavia, un modello recente si è dimostrato utile per la sperimentazione farmacologica di agenti terapeutici e immunoterapia². Come tale, abbiamo adattato un sistema di coltura a fetta organotipica, che è stato utilizzato in altri tipi di tumori umani, come cervello, seno, pancreas, polmone, ovaio e altri 3,4,5,6.

Oltre alle neoplasie appendicolari, la PMP occasionalmente deriva da altri tipi di tumore, compresi i tumori ovarici⁷ e, in rare circostanze, neoplasie mucinose papillari intraduttali⁸ e cancro del colon⁹. Inoltre, questi tumori tendono a crescere lentamente, con bassi tassi di innesto nei modelli di xenotrapianto derivato dal paziente (PDX)^10,11. Date queste sfide, c’è un bisogno insoddisfatto di sviluppare modelli per studiare questa malattia per iniziare a capire la patobiologia della PMP e come queste cellule tumorali: vengono reclutate sulle superfici peritoneali, proliferano e sfuggono alla sorveglianza immunitaria.

Mentre tagliate dalla circolazione vascolare sistemica, le fette tumorali contengono componenti cellulari e acellulari, tra cui la matrice extracellulare, le cellule stromali, le cellule immunitarie, le cellule tumorali, le cellule endoteliali e i nervi. Questo microambiente semi-intatto consente l’indagine funzionale di questi tipi di cellule, che è unicamente vantaggioso rispetto alle colture organoidi 3D, che consistono solo di cellule tumorali¹². Mentre le colture organotipiche a fette sono vantaggiose sotto alcuni aspetti, sono anche intrinsecamente un approccio basato su basse entrate, rispetto agli organoidi 3D, che possono essere ampliati e sono adatti per lo screening terapeutico sperimentale multiplex^13,14,15. Nel caso del PMP, non ci sono state segnalazioni che documentassero l’istituzione affidabile e il passaggio perpetuo di organoidi derivati da PMP¹⁶. Ciò è probabilmente dovuto alla natura a crescita lenta delle cellule tumorali derivate da PMP, nonché al basso numero di cellule epiteliali maligne presenti all’interno di questi tumori mucinosi. Data la necessità di sviluppare modelli per studiare la PMP, le fette organotipiche sono particolarmente adatte a studiare questa malattia. Presentiamo un protocollo per la preparazione, l’imaging e l’analisi di PMP da campioni umani.

Protocol

La deidentificazione e l’acquisizione di tutti i tessuti sono state eseguite secondo un protocollo approvato dall’IRB presso l’Università della California, San Diego. 1. Preparazione di tessuti PMP umani per la lavorazione e la coltura di tessuti Trasporto di tessuti tumorali e microdissezionePreparare i terreni di trasporto e coltura: completare il 10% (v/v) di Dulbecco Modified Eagle Media (DMEM), 10% FBS, 2 mM L-Glutammina, 1% Penicillina/Streptomycin (Pe…

Representative Results

In breve, i campioni di tumore umano da PMP sono ottenuti secondo un protocollo approvato dall’IRB. Il tessuto viene preparato, micro-sezionato e solidificato in uno stampo di agarosio per essere tagliato usando un vibratomo (Figura 1A; Video 1). Una volta tagliate, le fette di tessuto vengono posizionate e coltivate su membrane di inserto permeabili (Figura 1B), che possono essere utilizzate per saggi di imaging in situ, nonché per in…

Discussion

Questo manoscritto descrive una tecnica che può essere utilizzata per coltivare, interrogare e analizzare campioni di tumore umano di pseudomixoma peritonei (PMP). Abbiamo utilizzato numerosi saggi funzionali a valle per interrogare il microambiente immunitario del tumore e una piattaforma per i test da banco a letto.

Mentre il metodo è altamente efficiente nelle nostre mani, richiederà una certa pratica per tagliare campioni tumorali usando un vibratomo. Vale a dire, abbiamo riscontrato pr…

Materials

1 M CaCl2 solution	Sigma	21115
1 M HEPES solution	Sigma	H0887
1 M MgCl2 solution	Sigma	M1028
100 micron filter	ThermoFisher	22-363-549
22 x 40 glass coverslips	Daiggerbrand	G15972H
3 M KCl solution	Sigma	60135
5 M NaCl solution	Sigma	S5150
ATPγS	Tocris	4080
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153
Calcein-AM	Invitrogen	L3224
CD11b	Biolegend	101228
CD206	Biolegend	321140
CD3	Biolegend	555333
CD4	Biolegend	357410
CD45	Biolegend	304006
CD8	Biolegend	344721
CellTiter-Glo	Promega	G9681
DMEM	Thermo Fisher	11965084
DPBS	Sigma Aldrich	D8537
FBS, heat inactivated	ThermoFisher	16140071
Fc-block	BD Biosciences	564220
Fluo-4	Thermo Fisher	F14201
Gentle Collagenase/Hyaluronidase	Stem Cell	7912
Imaging Chamber	Warner Instruments	RC-26
Imaging Chamber Platform	Warner Instruments	PH-1
LD-Blue	Biolegend	L23105
L-Glutamine 200 mM	ThermoFisher	25030081
LIVE/DEAD imaging dyes	Thermofisher	R37601
Nikon Ti microscope	Nikon		Includes: A1R hybrid confocal scanner including a high-resolution (4096×4096) scanner, LU4 four-laser AOTF unit with 405, 488, 561, and 647 lasers, Plan Apo 10 (NA 0.8), 20X (NA 0.9) dry objectives.
Peristaltic pump	Isamtec	ISM832C
Propidium Iodide	Invitrogen	L3224
Vacuum silicone grease	Sigma	Z273554-1EA