切除されたヒト腫瘍標本からの ex vivo 器官型偽粘液腫腹膜腫瘍スライスの培養とイメージング
Summary
腹膜表面に転移したヒトがんの産生、培養、可視化のためのプロトコルについて説明します。切除した腫瘍標本をビブラトームを使用して切断し、透過性インサートで培養して酸素化と生存率を高めた後、共焦点顕微鏡とフローサイトメトリーを使用したイメージングとダウンストリーム分析を行います。
Abstract
腹膜偽粘液腫(PMP)は、粘液性原発腫瘍の播種とその結果としての腹腔内のムチン分泌腫瘍細胞の蓄積に起因するまれな状態です。PMPは、虫垂、卵巣、結腸直腸などのさまざまな種類の癌から発生する可能性がありますが、虫垂腫瘍が群を抜いて最も一般的な病因です。PMPは、その(1)希少性、(2)限られたマウスモデル、および(3)粘液性の無細胞組織学のために研究が困難です。ここで紹介する方法は、腫瘍微小環境(TME)が無傷のままである調製物において、患者由来の ex vivo 器官型スライスを使用して、これらの腫瘍タイプのリアルタイムの視覚化および調査を可能にする。このプロトコルでは、まず、ビブラトームを使用した腫瘍スライスの調製とその後の長期培養について説明します。次に、腫瘍スライスの共焦点イメージングと、生存率、カルシウムイメージング、および局所増殖の機能的読み出しを監視する方法について説明します。要するに、スライスにはイメージング色素が装填され、共焦点顕微鏡に取り付けることができるイメージングチャンバーに配置されます。タイムラプスビデオと共焦点画像を使用して、初期の生存率と細胞機能を評価します。この手順では、TMEにおける翻訳細胞運動、およびパラクリンシグナル伝達相互作用についても調べます。最後に、フローサイトメトリー分析に使用する腫瘍スライスの解離プロトコルについて説明します。定量的フローサイトメトリー分析は、ベンチからベッドサイドまでの治療試験に使用でき、免疫ランドスケープと上皮細胞含有量内で発生する変化を判断できます。
Introduction
腹膜偽粘液腫(PMP)はまれな症候群で、発生率は年間100万人あたり1人です1。ほとんどのPMP症例は虫垂腫瘍からの転移によって引き起こされます。マウスには人間のような虫垂がないことを考えると、このタイプの癌のモデル化は依然として非常に困難です。原発性疾患は外科的切除によって治癒することが多いが、転移性疾患の治療選択肢は限られている。したがって、この新しい有機型スライスモデルを開発する理論的根拠は、PMPの病理生物学を研究することです。現在まで、永久培養できる虫垂オルガノイドモデルはありません。しかし、最近のモデルは、治療薬の薬理学的試験および免疫療法に有用であることが示された2。そのため、脳、乳がん、膵臓がん、肺がん、卵巣がんなど、他の種類のヒトがんで使用されている有機型スライス培養システムを適応させました3,4,5,6。
虫垂腫瘍に加えて、PMPは時折、卵巣癌7、まれに膝管内乳頭粘液性腫瘍8および結腸癌9を含む他の腫瘍タイプから生じる。さらに、これらの腫瘍はゆっくりと成長する傾向があり、患者由来の異種移植片(PDX)モデルでは生着率が低くなります10,11。これらの課題を考えると、PMPの病理生物学と、これらの癌細胞がどのように腹膜表面に動員され、増殖し、免疫監視から逃れるかを理解し始めるために、この疾患を研究するためのモデルを開発する必要があります。
腫瘍スライスは、全身の血管循環から切り取られていますが、細胞外マトリックス、間質細胞、免疫細胞、癌細胞、内皮細胞、神経などの細胞および無細胞成分を含んでいます。この半無傷の微小環境は、これらの細胞タイプの機能的研究を可能にし、これは癌細胞のみからなる3Dオルガノイド培養と比較して独特の利点である12。オルガノタイプスライス培養はいくつかの点で有利であるが、それらはまた、拡張可能な3Dオルガノイドと比較して本質的に低スループットベースのアプローチであり、多重化された治験治療薬スクリーニングに適している13、14、15。PMPの場合、PMP由来のオルガノイドの信頼できる樹立と永続的な継代を文書化した報告はありません16。これは、PMP由来の腫瘍細胞の増殖が遅いこと、およびこれらの粘液性腫瘍内に見られる悪性上皮細胞の数が少ないことが原因である可能性があります。PMPを研究するためのモデルを開発する必要性を考えると、有機型スライスはこの病気を研究するのにユニークに適しています。ヒト検体からPMPを調製、イメージング、および分析するためのプロトコルを紹介します。
Protocol
Representative Results
Discussion
この原稿では、ヒト腹膜偽粘液腫(PMP)腫瘍標本の培養、尋問、分析に使用できる技術について説明しています。私たちは、腫瘍免疫微小環境を調べるために多数のダウンストリーム機能アッセイと、ベンチからベッドサイドまでのテストのためのプラットフォームを利用しました。
この方法は私たちの手の中で非常に効率的ですが、ビブラトームを使用して腫瘍標本を切…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
著者らは、顕微鏡UCSD専門がんサポートセンターP30助成金2P30CA023100を支援してくれたムーアがんセンターのイメージングコア施設のKersi Pestonjamaspに感謝したいと思います。この研究は、JoVE出版助成金(JRW)と、エリザベスとアドクリーマーズの財産、ユースケ家族財団、消化器がん研究基金、腹膜転移研究基金(AML)からの寛大な贈り物によってさらに支援されました。
Materials
| 1 M CaCl2 solution | Sigma | 21115 | |
| 1 M HEPES solution | Sigma | H0887 | |
| 1 M MgCl2 solution | Sigma | M1028 | |
| 100 micron filter | ThermoFisher | 22-363-549 | |
| 22 x 40 glass coverslips | Daiggerbrand | G15972H | |
| 3 M KCl solution | Sigma | 60135 | |
| 5 M NaCl solution | Sigma | S5150 | |
| ATPγS | Tocris | 4080 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A2153 | |
| Calcein-AM | Invitrogen | L3224 | |
| CD11b | Biolegend | 101228 | |
| CD206 | Biolegend | 321140 | |
| CD3 | Biolegend | 555333 | |
| CD4 | Biolegend | 357410 | |
| CD45 | Biolegend | 304006 | |
| CD8 | Biolegend | 344721 | |
| CellTiter-Glo | Promega | G9681 | |
| DMEM | Thermo Fisher | 11965084 | |
| DPBS | Sigma Aldrich | D8537 | |
| FBS, heat inactivated | ThermoFisher | 16140071 | |
| Fc-block | BD Biosciences | 564220 | |
| Fluo-4 | Thermo Fisher | F14201 | |
| Gentle Collagenase/Hyaluronidase | Stem Cell | 7912 | |
| Imaging Chamber | Warner Instruments | RC-26 | |
| Imaging Chamber Platform | Warner Instruments | PH-1 | |
| LD-Blue | Biolegend | L23105 | |
| L-Glutamine 200 mM | ThermoFisher | 25030081 | |
| LIVE/DEAD imaging dyes | Thermofisher | R37601 | |
| Nikon Ti microscope | Nikon | Includes: A1R hybrid confocal scanner including a high-resolution (4096×4096) scanner, LU4 four-laser AOTF unit with 405, 488, 561, and 647 lasers, Plan Apo 10 (NA 0.8), 20X (NA 0.9) dry objectives. | |
| Peristaltic pump | Isamtec | ISM832C | |
| Propidium Iodide | Invitrogen | L3224 | |
| Vacuum silicone grease | Sigma | Z273554-1EA |
Referências
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