Kultur og avbildning av Ex Vivo Organotypic Pseudomyxoma Peritonei Tumor Skiver fra resected Human Tumor Specimens

Summary

Vi beskriver en protokoll for produksjon, kultur og visualisering av humane kreftformer, som har metastasert til peritoneale overflater. Resekterte tumorprøver kuttes ved hjelp av en vibratome og dyrkes på permeable innlegg for økt oksygenering og levedyktighet, etterfulgt av avbildning og nedstrømsanalyser ved hjelp av konfokalmikroskopi og flowcytometri.

Abstract

Pseudomyxoma peritonei (PMP) er en sjelden tilstand som skyldes spredning av en mucinøs primærtumor og den resulterende akkumuleringen av mucinutskillende tumorceller i bukhulen. PMP kan oppstå fra ulike typer kreftformer, inkludert blindtarm, eggstokk og kolorektal, selv om appendikeale neoplasmer er langt den vanligste etiologien. PMP er utfordrende å studere på grunn av sin (1) sjeldenhet, (2) begrensede murine modeller, og (3) mucinøs, acellulær histologi. Metoden som presenteres her tillater sanntidsvisualisering og undersøkelse av disse tumortypene ved bruk av pasientavledede ex vivo organotypiske skiver i et preparat der tumormikromiljøet (TME) forblir intakt. I denne protokollen beskriver vi først fremstilling av tumorskiver ved hjelp av en vibratomi og påfølgende langtidskultur. For det andre beskriver vi konfokal avbildning av tumorskiver og hvordan man overvåker funksjonelle avlesninger av levedyktighet, kalsiumavbildning og lokal spredning. Kort sagt, skiver er lastet med bildebehandlingsfarger og plasseres i et bildekammer som kan monteres på et konfokalmikroskop. Time-lapse-videoer og konfokale bilder brukes til å vurdere den opprinnelige levedyktigheten og cellulær funksjonalitet. Denne prosedyren utforsker også translasjonell cellulær bevegelse og parakrine signaleringsinteraksjoner i TME. Til slutt beskriver vi en dissosiasjonsprotokoll for tumorskiver som skal brukes til flowcytometrianalyse. Kvantitativ flowcytometrianalyse kan brukes til benk-til-seng-terapeutisk testing for å bestemme endringer som skjer i immunlandskapet og epitelcelleinnhold.

Introduction

Pseudomyxoma peritonei (PMP) er sjeldent syndrom med en forekomst på 1 per million mennesker per år¹. De fleste PMP-tilfeller skyldes metastaser fra appendikeale svulster. Gitt at mus ikke har en menneskelignende blindtarm, er modellering av denne typen kreft fortsatt ekstremt utfordrende. Mens den primære sykdommen ofte kan kureres ved kirurgisk reseksjon, er behandlingsmuligheter for metastatisk sykdom begrenset. Derfor er begrunnelsen for å utvikle denne nye organotypiske skivemodellen å studere patobiologien til PMP. Til dags dato er det ingen appendikale organoidmodeller som kan dyrkes evig; Imidlertid ble en nylig modell vist å være nyttig for farmakologisk testing av terapeutiske midler og immunterapi². Som sådan har vi tilpasset et organotypisk skivekultursystem, som har blitt brukt i andre typer menneskelige kreftformer, som hjerne, bryst, bukspyttkjertel, lunge, eggstokk og andre 3,4,5,6.

I tillegg til appendikeale neoplasmer, skyldes PMP av og til andre tumortyper, inkludert eggstokkreft⁷, og i sjeldne tilfeller intraduktale papillære mucinøse neoplasmer⁸ og tykktarmskreft⁹. I tillegg har disse svulstene en tendens til å vokse sakte, med dårlige engrafthastigheter i pasientavledet xenograft (PDX) modeller^10,11. Gitt disse utfordringene, er det et uoppfylt behov for å utvikle modeller for å studere denne sykdommen for å begynne å forstå patobiologien til PMP, og hvordan disse kreftcellene: rekrutteres til peritoneale overflater, sprer seg og unnslipper immunovervåking.

Mens de er kuttet fra den systemiske vaskulære sirkulasjonen, inneholder tumorskiver cellulære og acellulære komponenter, inkludert den ekstracellulære matrisen, stromale celler, immunceller, kreftceller, endotelceller og nerver. Dette semi-intakte mikromiljøet muliggjør funksjonell undersøkelse av disse celletypene, noe som er unikt fordelaktig sammenlignet med 3D-organoidkulturer, som bare består av kreftceller¹². Mens organotypiske skivekulturer er fordelaktige i noen henseender, er de også iboende en lavkapasitetsbasert tilnærming, sammenlignet med 3D-organoider, som kan utvides, og er egnet for multiplekset undersøkelsesterapeutisk legemiddelscreening^13,14,15. Når det gjelder PMP, er det ikke rapportert om pålitelig etablering og evigvarende passering av PMP-deriverte organoider¹⁶. Dette skyldes sannsynligvis den langsomt voksende naturen til PMP-avledede tumorceller, samt det lave antallet ondartede epitelceller som finnes i disse mucinøse svulstene. Gitt behovet for å utvikle modeller for å studere PMP, er organotypiske skiver unikt egnet til å studere denne sykdommen. Vi presenterer en protokoll for å forberede, avbilde og analysere PMP fra humane prøver.

Protocol

Avidentifisering og oppkjøp av alle vev ble utført under en IRB-godkjent protokoll ved University of California, San Diego. 1. Fremstilling av humant PMP-vev for vevsbehandling og kultur Transport av tumorvev og mikrodisseksjonForbered transport- og kulturmediet: fullfør 10% (v / v) Dulbecco’s Modified Eagle Media (DMEM), 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 1% penicillin / streptomycin (Pen streptokokker). Ved vevsankomst og i henhold til en institusjonel…

Representative Results

Kort sagt, humane tumorprøver fra PMP oppnås under en IRB-godkjent protokoll. Vevet fremstilles, mikrodissekeres og størknes i en agaroseform som skal kuttes ved hjelp av en vibratome (figur 1A; Video 1). Etter kutt plasseres vevsskiver og dyrkes på permeable innsatsmembraner (figur 1B), som kan brukes til avbildningsanalyser in situ, samt til cellulær og funksjonell avhør ved hjelp av flowcytometri, konfokal bildeanalyse og cytot…

Discussion

Dette manuskriptet beskriver en teknikk som kan brukes til å dyrke, forhøre og analysere humane pseudomyxoma peritonei (PMP) tumorprøver. Vi har benyttet mange nedstrøms funksjonelle analyser for å forhøre tumorimmunmikromiljøet og en plattform for benk-til-senge-testing.

Selv om metoden er svært effektiv i våre hender, vil det kreve litt øvelse å kutte tumorprøver ved hjelp av en vibratom. Vi opplevde nemlig problemer som skyldtes svært mucinøse prøver, samt prøver som feilakt…

Materials

1 M CaCl2 solution	Sigma	21115
1 M HEPES solution	Sigma	H0887
1 M MgCl2 solution	Sigma	M1028
100 micron filter	ThermoFisher	22-363-549
22 x 40 glass coverslips	Daiggerbrand	G15972H
3 M KCl solution	Sigma	60135
5 M NaCl solution	Sigma	S5150
ATPγS	Tocris	4080
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153
Calcein-AM	Invitrogen	L3224
CD11b	Biolegend	101228
CD206	Biolegend	321140
CD3	Biolegend	555333
CD4	Biolegend	357410
CD45	Biolegend	304006
CD8	Biolegend	344721
CellTiter-Glo	Promega	G9681
DMEM	Thermo Fisher	11965084
DPBS	Sigma Aldrich	D8537
FBS, heat inactivated	ThermoFisher	16140071
Fc-block	BD Biosciences	564220
Fluo-4	Thermo Fisher	F14201
Gentle Collagenase/Hyaluronidase	Stem Cell	7912
Imaging Chamber	Warner Instruments	RC-26
Imaging Chamber Platform	Warner Instruments	PH-1
LD-Blue	Biolegend	L23105
L-Glutamine 200 mM	ThermoFisher	25030081
LIVE/DEAD imaging dyes	Thermofisher	R37601
Nikon Ti microscope	Nikon		Includes: A1R hybrid confocal scanner including a high-resolution (4096×4096) scanner, LU4 four-laser AOTF unit with 405, 488, 561, and 647 lasers, Plan Apo 10 (NA 0.8), 20X (NA 0.9) dry objectives.
Peristaltic pump	Isamtec	ISM832C
Propidium Iodide	Invitrogen	L3224
Vacuum silicone grease	Sigma	Z273554-1EA