Odling och avbildning av ex vivo organotypiska pseudomyxoma peritonei tumörskivor från resekterade humana tumörprover

Summary

Vi beskriver ett protokoll för produktion, odling och visualisering av mänskliga cancerformer, som har metastaserat till peritoneala ytor. Resekterade tumörprover skärs med hjälp av en vibratom och odlas på permeabla insatser för ökad syresättning och livskraft, följt av avbildning och nedströmsanalyser med konfokalmikroskopi och flödescytometri.

Abstract

Pseudomyxoma peritonei (PMP) är ett sällsynt tillstånd som härrör från spridningen av en mucinös primärtumör och den resulterande ackumuleringen av mucinutsöndrande tumörceller i bukhålan. PMP kan uppstå från olika typer av cancer, inklusive appendiceal, ovarian och kolorektal, även om appendiceal neoplasmer är den överlägset vanligaste etiologin. PMP är utmanande att studera på grund av dess (1) sällsynthet, (2) begränsade murina modeller och (3) mucinös, acellulär histologi. Metoden som presenteras här möjliggör visualisering och förhör i realtid av dessa tumörtyper med hjälp av patienthärledda ex vivo organotypiska skivor i ett preparat där tumörmikromiljön (TME) förblir intakt. I detta protokoll beskriver vi först beredningen av tumörskivor med användning av en vibratom och efterföljande långsiktig kultur. För det andra beskriver vi konfokal avbildning av tumörskivor och hur man övervakar funktionella avläsningar av livskraft, kalciumavbildning och lokal spridning. Kort sagt, skivor laddas med bildfärger och placeras i en bildkammare som kan monteras på ett konfokalmikroskop. Timelapse-videor och konfokala bilder används för att bedöma den ursprungliga livskraften och cellulära funktioner. Denna procedur undersöker också translationella cellulära rörelser och parakrina signalinteraktioner i TME. Slutligen beskriver vi ett dissociationsprotokoll för tumörskivor som ska användas för flödescytometrianalys. Kvantitativ flödescytometrianalys kan användas för terapeutisk testning från bänk till säng för att bestämma förändringar som sker inom immunlandskapet och epitelcellinnehållet.

Introduction

Pseudomyxoma peritonei (PMP) är sällsynt syndrom med en incidens på 1 per miljon människor per år¹. De flesta PMP-fall orsakas av metastaser från appendiceala neoplasmer. Med tanke på att möss inte har en människoliknande bilaga är modellering av denna typ av cancer fortfarande extremt utmanande. Medan den primära sjukdomen ofta kan botas genom kirurgisk resektion, är behandlingsalternativen för metastatisk sjukdom begränsade. Därför är motiveringen för att utveckla denna nya organotypiska skivmodell att studera patobiologin hos PMP. Hittills finns det inga appendiceala organoidmodeller som kan odlas ständigt; En ny modell visade sig dock vara användbar för farmakologisk testning av terapeutiska medel och immunterapi². Som sådan har vi anpassat ett organotypiskt skivkultursystem, som har använts i andra typer av mänskliga cancerformer, såsom hjärna, bröst, bukspottkörtel, lunga, äggstockar och andra 3,4,5,6.

Förutom appendiceala neoplasmer resulterar PMP ibland från andra tumörtyper, inklusive äggstockscancer⁷, och i sällsynta fall intraduktala papillära mucinösa neoplasmer⁸ och tjocktarmscancer⁹. Dessutom tenderar dessa tumörer att växa långsamt, med dåliga transplantathastigheter i patient-derived xenograft (PDX) modeller^10,11. Med tanke på dessa utmaningar finns det ett ouppfyllt behov av att utveckla modeller för att studera denna sjukdom för att börja förstå patobiologin hos PMP och hur dessa cancerceller rekryteras till bukhinnans ytor, förökar sig och undgår immunövervakning.

Medan de skärs från den systemiska vaskulära cirkulationen innehåller tumörskivor cellulära och acellulära komponenter, inklusive den extracellulära matrisen, stromaceller, immunceller, cancerceller, endotelceller och nerver. Denna halvintakta mikromiljö möjliggör funktionell undersökning av dessa celltyper, vilket är unikt fördelaktigt jämfört med 3D-organoidkulturer, som endast består av cancerceller¹². Medan organotypiska skivkulturer är fördelaktiga i vissa avseenden, är de också i sig ett lågkapacitetsbaserat tillvägagångssätt jämfört med 3D-organoider, som kan utökas och är lämpliga för multiplex terapeutisk läkemedelsscreening^13,14,15. När det gäller PMP har det inte förekommit några rapporter som dokumenterar tillförlitlig etablering och evig passage av PMP-härledda organoider¹⁶. Detta beror sannolikt på den långsamt växande karaktären hos PMP-härledda tumörceller, liksom det låga antalet maligna epitelceller som finns i dessa mucinösa tumörer. Med tanke på behovet av att utveckla modeller för att studera PMP är organotypiska skivor unikt lämpade för att studera denna sjukdom. Vi presenterar ett protokoll för att förbereda, avbilda och analysera PMP från mänskliga prover.

Protocol

Avidentifiering och förvärv av alla vävnader utfördes enligt ett IRB-godkänt protokoll vid University of California, San Diego. 1. Beredning av humana PMP-vävnader för vävnadsbearbetning och odling Transport av tumörvävnader och mikrodissektionFörbered transport- och odlingsmedia: komplett 10% (v / v) Dulbeccos modifierade örnmedia (DMEM), 10% FBS, 2 mM L-glutamin, 1% penicillin / streptomycin (Pen Strep). Vid vävnadens ankomst och enl…

Representative Results

Kort sagt, humana tumörprover från PMP erhålls under ett IRB-godkänt protokoll. Vävnaden bereds, mikrodissekeras och stelnar i en agarosform för att skäras med hjälp av en vibratom (figur 1A; Videoklipp 1). När vävnadsskivorna har skurits placeras de och odlas på permeabla insatsmembran (figur 1B), som kan användas för avbildningsanalyser in situ, såväl som för cellulära och funktionella förhör med flödescytometri, k…

Discussion

Detta manuskript beskriver en teknik som kan användas för att odla, förhöra och analysera humana pseudomyxoma peritonei (PMP) tumörprover. Vi har använt många nedströms funktionella analyser för att förhöra tumörens immunmikromiljö och en plattform för bänk-till-säng-testning.

Medan metoden är mycket effektiv i våra händer, kommer det att kräva viss övning att skära tumörprover med hjälp av en vibratom. Vi stötte nämligen på problem som berodde på mycket mucinösa p…

Materials

1 M CaCl2 solution	Sigma	21115
1 M HEPES solution	Sigma	H0887
1 M MgCl2 solution	Sigma	M1028
100 micron filter	ThermoFisher	22-363-549
22 x 40 glass coverslips	Daiggerbrand	G15972H
3 M KCl solution	Sigma	60135
5 M NaCl solution	Sigma	S5150
ATPγS	Tocris	4080
Bovine Serum Albumin	Sigma	A2153
Calcein-AM	Invitrogen	L3224
CD11b	Biolegend	101228
CD206	Biolegend	321140
CD3	Biolegend	555333
CD4	Biolegend	357410
CD45	Biolegend	304006
CD8	Biolegend	344721
CellTiter-Glo	Promega	G9681
DMEM	Thermo Fisher	11965084
DPBS	Sigma Aldrich	D8537
FBS, heat inactivated	ThermoFisher	16140071
Fc-block	BD Biosciences	564220
Fluo-4	Thermo Fisher	F14201
Gentle Collagenase/Hyaluronidase	Stem Cell	7912
Imaging Chamber	Warner Instruments	RC-26
Imaging Chamber Platform	Warner Instruments	PH-1
LD-Blue	Biolegend	L23105
L-Glutamine 200 mM	ThermoFisher	25030081
LIVE/DEAD imaging dyes	Thermofisher	R37601
Nikon Ti microscope	Nikon		Includes: A1R hybrid confocal scanner including a high-resolution (4096×4096) scanner, LU4 four-laser AOTF unit with 405, 488, 561, and 647 lasers, Plan Apo 10 (NA 0.8), 20X (NA 0.9) dry objectives.
Peristaltic pump	Isamtec	ISM832C
Propidium Iodide	Invitrogen	L3224
Vacuum silicone grease	Sigma	Z273554-1EA