Waiting
Processando Login

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

إنشاء وتوصيف نماذج الطعم الخارجي المشتقة من المريض لسرطان الغدة الدرقية الكشمي وسرطان الخلايا الحرشفية في الرأس والرقبة

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/64623
Automatic Translation
1,3, 2, 3, 4, 3, 3, 1,3, 1,3, 2, 1,3
1Precision Medicine Research Center, Sichuan Provincial Key Laboratory of Precision Medicine, National Clinical Research Center for Geriatrics, West China Hospital, Sichuan University, 2Department of Thyroid Surgery, West China Hospital, Sichuan University, 3Sichuan Kangcheng Biotech Co., 4Sichuan Cancer Hospital

Summary

ينشئ البروتوكول الحالي ويميز نموذج xenograft المشتق من المريض (PDX) لسرطان الغدة الدرقية الكشمي (ATC) وسرطان الخلايا الحرشفية في الرأس والرقبة (HNSCC) ، حيث أصبحت نماذج PDX بسرعة المعيار في مجال علم الأورام الانتقالي.

Abstract

تحافظ نماذج xenograft المشتقة من المريض (PDX) بأمانة على الخصائص النسيجية والجينية للورم الرئيسي وتحافظ على عدم تجانسه. ترتبط نتائج الديناميكا الدوائية القائمة على نماذج PDX ارتباطا وثيقا بالممارسة السريرية. سرطان الغدة الدرقية الكشمي (ATC) هو النوع الفرعي الأكثر خبيثة من سرطان الغدة الدرقية ، مع غزو قوي ، وسوء التشخيص ، والعلاج المحدود. على الرغم من أن معدل الإصابة ب ATC يمثل 2٪ -5٪ فقط من سرطان الغدة الدرقية ، إلا أن معدل الوفيات يصل إلى 15٪ -50٪. يعد سرطان الخلايا الحرشفية في الرأس والرقبة (HNSCC) أحد أكثر الأورام الخبيثة شيوعا في الرأس والرقبة ، مع أكثر من 600000 حالة جديدة في جميع أنحاء العالم كل عام. هنا ، يتم تقديم بروتوكولات مفصلة لإنشاء نماذج PDX من ATC و HNSCC. في هذا العمل ، تم تحليل العوامل الرئيسية التي تؤثر على معدل نجاح بناء النموذج ، وتمت مقارنة السمات النسيجية المرضية بين نموذج PDX والورم الرئيسي. علاوة على ذلك ، تم التحقق من الأهمية السريرية للنموذج من خلال تقييم الفعالية العلاجية في الجسم الحي للأدوية التمثيلية المستخدمة سريريا في نماذج PDX التي تم بناؤها بنجاح.

Introduction

نموذج PDX هو نموذج حيواني يتم فيه زرع أنسجة الورم البشري في الفئران التي تعاني من نقص المناعة وتنمو في البيئة التي توفرها الفئران1. تعاني نماذج خط الخلايا السرطانية التقليدية من العديد من العيوب ، مثل عدم التجانس ، وعدم القدرة على الاحتفاظ بالبيئة المكروية للورم ، والتعرض للاختلافات الجينية أثناء الممرات المتكررة في المختبر ، والتطبيق السريريالسيئ 2,3. تتمثل العيوب الرئيسية للنماذج الحيوانية المعدلة وراثيا في الخسارة المحتملة للسمات الجينومية للأورام البشرية ، وإدخال طفرات جديدة غير معروفة ، وصعوبة تحديد درجة التماثل بين أورام الفئران والأورام البشرية4. بالإضافة إلى ذلك ، فإن إعداد النماذج الحيوانية المعدلة وراثيا مكلف ويستغرق وقتا طويلا وغير فعال نسبيا4.

يتميز نموذج PDX بالعديد من المزايا مقارنة بنماذج الأورام الأخرى من حيث عكس عدم تجانس الورم. من منظور علم التشريح المرضي ، على الرغم من أن نظير الفأر يحل محل السدى البشري بمرور الوقت ، فإن نموذج PDX يحافظ على البنية المورفولوجية للورم الرئيسي جيدا. بالإضافة إلى ذلك ، يحافظ نموذج PDX على الهوية الأيضية للورم الرئيسي لمدة أربعة أجيال على الأقل ويعكس بشكل أفضل العلاقات المتبادلة المعقدة بين الخلايا السرطانية وبيئتها المكروية ، مما يجعله فريدا في محاكاة النمو ، ورم خبيث ، وتكوين الأوعية ، وكبت المناعة لأنسجة الورم البشري5،6،7. على المستويين الخلوي والجزيئي ، يعكس نموذج PDX بدقة عدم تجانس الأورام البشرية بين الأورام وداخلها ، بالإضافة إلى الخصائص المظهرية والجزيئية للسرطان الأصلي ، بما في ذلك أنماط التعبير الجيني ، وحالة الطفرة ، ورقم النسخ ، ومثيلة الحمض النووي والبروتينات 8,9. نماذج PDX ذات الممرات المختلفة لها نفس الحساسية للعلاج الدوائي ، مما يشير إلى أن التعبير الجيني لنماذج PDX مستقر للغاية10,11. أظهرت الدراسات وجود علاقة ممتازة بين استجابة نموذج PDX للدواء والاستجابات السريرية للمرضى لهذا الدواء12,13. لذلك ، ظهر نموذج PDX كنموذج بحثي قوي قبل السريري ومتعدي ، خاصة لفحص الأدوية والتنبؤ بالتشخيص السريري.

سرطان الغدة الدرقية هو ورم خبيث شائع في نظام الغدد الصماء وهو ورم خبيث بشري أظهر زيادة سريعة في الإصابة في السنوات الأخيرة14. سرطان الغدة الدرقية الكشمي (ATC) هو أكثر أنواع سرطان الغدة الدرقية خبثا ، حيث يبلغ متوسط بقاء المريض على قيد الحياة 4.8 شهرا فقط15. على الرغم من أن أقلية فقط من مرضى سرطان الغدة الدرقية يتم تشخيصهم ب ATC كل عام في الصين ، إلا أن معدل الوفيات يقترب من 100٪ 16،17،18. عادة ما ينمو ATC بسرعة ويغزو الأنسجة المجاورة للرقبة وكذلك الغدد الليمفاوية العنقية ، وحوالي نصف المرضى لديهم نقائل بعيدة19,20. سرطان الخلايا الحرشفية في الرأس والرقبة (HNSCC) هو سادس أكثر أنواع السرطان شيوعا في العالم وأحد الأسباب الرئيسية لوفيات السرطان ، حيث يعاني ما يقدر بنحو 600000 شخص من HNSCC كل عام21،22،23. يشمل HNSCC عددا كبيرا من الأورام ، بما في ذلك الأورام الموجودة في الأنف والجيوب الأنفية والفم واللوزتين والبلعوم والحنجرة24. ATC و HNSCC هما من الأورام الخبيثة الرئيسية في الرأس والرقبة. من أجل تسهيل تطوير عوامل علاجية جديدة وعلاجات شخصية ، من الضروري تطوير نماذج حيوانية قوية ومتقدمة قبل السريرية مثل نماذج PDX من ATC و HNSCC.

تقدم هذه المقالة طرقا مفصلة لإنشاء نموذج PDX تحت الجلد ل ATC و HNSCC ، وتحلل العوامل الرئيسية التي تؤثر على معدل أخذ الورم في بناء النموذج ، وتقارن الخصائص النسيجية المرضية بين نموذج PDX والورم الرئيسي. وفي الوقت نفسه ، في هذا العمل ، تم إجراء اختبارات الديناميكا الدوائية في الجسم الحي باستخدام نماذج PDX التي تم إنشاؤها بنجاح من أجل التحقق من أهميتها السريرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

تم إجراء جميع التجارب على الحيوانات وفقا لجمعية تقييم واعتماد إرشادات وبروتوكولات رعاية المختبر المعتمدة من قبل اللجنة المؤسسية لرعاية واستخدام الحيوان في مستشفى غرب الصين بجامعة سيتشوان. تم استخدام الفئران التي تعاني من نقص المناعة NOD-SCID الذين تتراوح أعمارهم بين 4-6 أسابيع (من كلا الجنسين) وإناث الفئران العارية Balb / c الذين تتراوح أعمارهم بين 4-6 أسابيع في هذه الدراسة. تم الحصول على الحيوانات من مصدر تجاري (انظر جدول المواد). أذنت لجنة الأخلاقيات في مستشفى غرب الصين بالدراسة مع البشر (رقم البروتوكول 2020353). قدم كل مريض موافقة خطية مستنيرة.

1. التحضير التجريبي

  1. قم بترتيب الشفرات التي تستخدم لمرة واحدة ، والمقص والملاقط المعقمة ، والأدوات الأخرى اللازمة لزراعة الورم ، وضعها على طاولة العمل فائقة النظافة ، وقم بتشعيعها بالأشعة فوق البنفسجية مسبقا.
  2. تحضير أطباق ملحية وبتري معقمة لاستخدامها أثناء الاختبار.

2. اكتساب ونقل أنسجة الورم الطازجة

  1. احصل على عينات ورم جديدة (عادة ما تكون أكبر من 5 مم × 5 مم في الحجم) من غرفة العمليات ، وضعها في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل أو 50 مل يحتوي على محلول HTK معقم (انظر جدول المواد) أو محلول ملحي. قم بتسمية أنابيب الطرد المركزي.
    ملاحظة: تم الحصول على عينات الورم الطازجة عن طريق الاستئصال الجراحي أو ثقب من المرضى الذين يعانون من ATC أو HNSCC.
  2. ضع أنابيب الطرد المركزي في صندوق ثلج معد مسبقا.
    ملاحظة: خلال هذا الوقت ، يجب على مشغل الزرع إعداد العناصر اللازمة للزراعة (انظر جدول المواد).
  3. تأكد من أن الوقت بين جمع العينات ونقلها إلى المختبر لبناء PDX لا يتجاوز 2 ساعة. أثناء النقل ، قم بإحاطة الأنابيب التي تحتوي على الأنسجة بخليط من الماء المثلج أو أكياس الثلج للحفاظ على نشاط الأنسجة.

3. زرع الورم

  1. بمجرد وصول أنسجة الورم إلى المختبر ، قم بتسجيلها وإعادة ترقيمها.
    ملاحظة: بالنسبة للدراسة الحالية ، تم الاحتفاظ بمعلومات المريض بسرية تامة. ونفذت الخطوات المتبقية من الإجراء في مختبر من المستوى 2 للسلامة الأحيائية (BSL-2). عند دخول المختبر ، يوصى بارتداء سترة فوق ملابس العمل أو الملابس الواقية وقبعة وقناع. يتم علاج أنسجة الورم في خزانة السلامة الحيوية.
  2. تطهير أنابيب الطرد المركزي التي تحتوي على أنسجة الورم مع الكحول بنسبة 75 ٪ ، ووضعها على طاولة العمليات. نقل أنسجة الورم إلى أطباق بتري 6 سم مملوءة بالمحلول الملحي باستخدام ملقط العيون المعقمة. بعد ذلك ، قم بتقطيعها إلى قطع صغيرة تبلغ حوالي 2 مم × 2 مم و 3 مم × 3 مم باستخدام شفرة.
  3. انقل قطع أنسجة الورم إلى طبق بتري 6 سم يحتوي على الكمية المناسبة من المحلول الملحي ، ولف الطبق بغشاء مانع للتسرب ، وضعه في صندوق ثلج ، واحمله إلى غرفة الحيوانات المحددة الخالية من مسببات الأمراض (SPF) جنبا إلى جنب مع الأدوات اللازمة (مقص ، ملقط ، وإبر تلقيح).
  4. تحضير الحيوان باتباع الخطوات أدناه.
    1. قم بإزالة الشعر الموجود على الصدر الجانبي الأيمن للإناث أو الذكور الذين يعانون من نقص المناعة NOD-SCID بعمر 4-6 أسابيع ، وقم بتطهير الجلد بنسبة 75٪ كحول. تخدير الفئران عن طريق الحقن داخل الصفاق من 80 ملغم / كغم من الكيتامين و 10 ملغ / كغ من الزيلازين (انظر جدول المواد) ، وتشويه عيونهم بمرهم بيطري لمنع الجفاف. تأكيد عمق التخدير عن طريق فقدان منعكس الدواسة.
    2. قم بعمل شق 2 مم بمقص عبر الجلد في منتصف الصدر الجانبي الأيمن للفئران.
  5. خذ قطعة ورم من طبق بتري ، وضعها في إبرة المبزل 2.4 مم × 2.0 مم (انظر جدول المواد) بالملقط.
  6. امسك الماوس ، وشد الجلد في موقع البزل ، واستخدم المبزل الذي يحتوي على قطع الورم لإدخال الورم من خلال شق الجلد الأولي 2 مم ، وانتقل إلى الجزء الخلفي من الكتف ، وادفع قلب المبزل.
  7. تأكد من دفع قطعة الورم للخارج وتركها في الجيب الانتقالي الذي يتكون من ثقب المبزل ، ثم اسحب المبزل.
  8. إذا تحرك الورم بالإبرة عند سحبه ، فاستخدم المبزل لإعادة ضبطه وخياطة الشق.
    ملاحظة: في هذه الدراسة ، تم تلقيح كل فأر في المقدمة الظهرية والأطراف الخلفية. تم تلقيح واحد إلى ثلاثة فئران لكل عينة ورم من كل مريض بناء على حجم الورم.

4. الحفاظ على أنسجة الورم وتثبيتها وتجميد البروتين

ملاحظة: تم استخدام أنسجة الورم المتبقية لحفظ البذور وتثبيتها وتجميد الحمض النووي / الحمض النووي الريبي / البروتين ، على التوالي.

  1. قم بإزالة المحلول الملحي من سطح الورم بشاش معقم قبل وضعه في أنبوب الحفظ بالتبريد للتأكد من أن سطح الورم ليس رطبا بشكل مفرط.
  2. ضع أربع إلى ست قطع من أنسجة الورم 2 مم × 2 مم في أنبوب الحفظ بالتبريد للخلايا سعة 2 مل ، وأضف 1 مل من محلول الحفظ بالتبريد المكون من 90٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 10٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) في الأنبوب ، ضع الأنبوب في صندوق تبريد متدرج ، وقم بتجميده عند -80 درجة مئوية طوال الليل ، وأخيرا ، نقله إلى النيتروجين السائل.
  3. ضع كتل أنسجة الورم 3 مم × 3 مم في الفورمالين المخزن بنسبة 10٪ لتثبيت الأنسجة للفحص المرضي.
  4. ضع كتلة الأنسجة 3 مم × 3 مم في أنبوب الحفظ بالتبريد للخلايا سعة 2 مل ، وقم بتجميدها بسرعة في النيتروجين السائل ، ثم انقلها إلى ثلاجة -80 درجة مئوية لاستخراج الحمض النووي / الحمض النووي الريبي والبروتين.
  5. جمع المعلومات السريرية للمرضى ، مثل تاريخ التدخين ، وحجم الورم ، والتمايز ، والنوع الفرعي المرضي ، ودرجة السرطان ، ومرحلة السرطان ، وورم خبيث بعيد ، والأصل ، والتاريخ الطبي ، والكيمياء المناعية ، وعدوى فيروس الورم الحليمي البشري (HPV) في مرضى HNSCC ، وأدوية العلاج.

5. تمرير وحفظ وإنعاش أورام نموذج PDX

  1. قم بقياس طول وعرض الأورام تحت الجلد في الفئران باستخدام ملاقط الورنية مرة واحدة في الأسبوع ، واحسب حجم الورم وفقا للصيغة: حجم الورم = 0.5 × طول × عرض2. ارسم منحنى نمو الورم.
  2. عندما يصل ورم PDX إلى 2000 مم3 ، قم بتمريره إلى الجيل التالي من الفئران ، وقم بإعادة زرع الورم. قم بإعداد الأدوات باتباع الخطوة 4.
  3. القتل الرحيم للفئران عن طريق خلع عنق الرحم بعد تخديره ب 80 مغ / كغ من الكيتامين.
  4. تطهير الجلد مع الكحول 75 ٪. ثم ، قم بقص الجلد المحيط بالورم باستخدام المقص ، ثم قم بإزالة الورم بالملقط ، وضعه في طبق بتري.
  5. قم بإجراء عملية زرع الورم باتباع الخطوة 3.
  6. قم بإجراء الحفظ والحفظ بالتبريد لأورام نموذج PDX باتباع الخطوة 4.
  7. لإنعاش أنسجة الورم ، اتبع مبدأ التجميد البطيء والذوبان السريع. بعد إخراج المبردات من النيتروجين السائل ، ضعها بسرعة في حمام مائي عند 37 درجة مئوية للذوبان السريع.
  8. هز بلطف cryovials في حمام مائي لتسريع عملية الذوبان.
  9. ذوبان الجليد ، ونقل قطع الورم إلى المياه المالحة العادية المعدة للغسيل ، ثم تلقيح الجيل القادم من الفئران. بالنسبة للعملية المحددة ، يرجى الاطلاع على إجراء زرع الأنسجة في الخطوة 3.

6. تحديد الفعالية العلاجية للينفاتينيب والسيسبلاتين في نموذج ATC PDX

ملاحظة: تم استخدام نموذج ATC PDX لاختبار التأثير العلاجي لمثبط التيروزين كيناز lenvatinib وعقار العلاج الكيميائي سيسبلاتين25،26،27.

  1. حدد نسيج الورم من الجيل P5 لنموذج ATC PDX (THY-017) ، مقطعة إلى 2-4 مم 3 قطع أنسجة ، وقم بتلقيحها تحت الجلد (الخطوة3 ) إلى الجزء الخلفي الأيمن من عشرة فئران عارية من 4-6 أسابيع Balb / c.
  2. حدد 15 فأرا بأحجام ورم تتراوح بين 50-150 مم3 ، وقسمها إلى ثلاث مجموعات.
  3. تطبيق لينفاتينيب (10 ملغ/ كغ) داخل المعدة لمجموعة واحدة مرة واحدة يوميا لمدة 15 يوما، تطبيق سيسبلاتين (3 ملغ/كغ) داخل الصفاق لمجموعة واحدة كل 3 أيام لما مجموعه ست جرعات، وتطبيق المجموعة الضابطة بنفس الحجم من المحلول الملحي العادي.
  4. قياس وزن الجسم وحجم الورم من الفئران مرتين في الأسبوع.
  5. في نهاية الاختبار ، القتل الرحيم للفئران (الخطوة 5.3) ، ووزن الأورام.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

تم زرع ما مجموعه 18 عينة من سرطان الغدة الدرقية ، وتم بناء خمسة نماذج PDX لسرطان الغدة الدرقية بنجاح (معدل أخذ الورم بنسبة 27.8٪) ، بما في ذلك أربع حالات من سرطانات الغدة الدرقية غير المتمايزة وحالة واحدة من سرطان الغدة الدرقية الكشمي. تم تحليل العلاقة بين معدل نجاح بناء النموذج والعمر والجنس وقطر الورم ودرجة الورم والتمايز. على الرغم من أن معدل نجاح النموذج لعينات الورم من الدرجة 4 كان أعلى من العينات ذات الدرجات المنخفضة ، وكان معدل نجاح عينات الورم غير المتمايزة أعلى أيضا من العينات شديدة التمايز ، أظهرت نتائج تحليل الارتباط أن هذه العوامل لم تكن مرتبطة بمعدل نجاح نموذج PDX (الجدول 1). تم تلقيح سبعة عشر عينة من HNSCC ، وتم بناء أربعة نماذج PDX من HNSCCC بنجاح. أظهر تحليل الارتباط بين معدل أخذ الورم في بناء النموذج والمعلمات السريرية لعينات الورم أن درجة التمايز كانت مرتبطة بمعدل نجاح النموذج ، في حين أن العمر والجنس وتاريخ التدخين وقطر الورم ودرجة السرطان وورم خبيث وعدوى فيروس الورم الحليمي البشري لم تؤثر على معدل أخذ الورم (الجدول 2).

تم رسم منحنيات نمو الورم لكل نموذج PDX لفهم معدلات نمو نماذج PDX بشكل أفضل من مرضى مختلفين (الشكل 1 والشكل 2 والجدول 3). كان متوسط دورات الأورام (الوقت من التلقيح إلى حجم الورم 1000 مم3) ل THY-004 من الأجيال P0 إلى P5 68 يوما و 87 يوما و 29 يوما و 34 يوما و 28 يوما و 26 يوما على التوالي. كان متوسط الدورات السرطانية ل THY-012 من الأجيال P0 إلى P5 119 يوما و 61 يوما و 66 يوما و 55 يوما و 87 يوما و 116 يوما على التوالي. كان متوسط الدورات السرطانية ل THY-017 من الأجيال P0 إلى P5 27 يوما و 17 يوما و 30 يوما و 13 يوما و 22 يوما و 15 يوما على التوالي. كان متوسط الدورات السرطانية ل THY-018 من الأجيال P0 إلى P3 134 يوما و 70 يوما و 48 يوما و 48 يوما على التوالي. كان متوسط دورات الأورام ل THY-021 من الأجيال P0 إلى P3 53 يوما و 66 يوما و 35 يوما و 49 يوما على التوالي. كان متوسط الدورات السرطانية ل OTO-017 من الأجيال P0 إلى P4 118 يوما و 86 يوما و 67 يوما و 129 يوما و 88 يوما على التوالي. كان متوسط دورات الأورام من OTO-022 من الأجيال P0 إلى P5 155 يوما و 55 يوما و 32 يوما و 37 يوما و 27 يوما و 46 يوما على التوالي. كان متوسط دورات الأورام ل OTO-030 من الأجيال P0 إلى P2 133 يوما و 93 يوما و 104 يوما على التوالي. كان متوسط الدورات السرطانية ل OTO-031 من الأجيال P0 إلى P5 144 يوما و 58 يوما و 33 يوما و 34 يوما و 52 يوما و 50 يوما على التوالي. تم تمرير عينات ATC بثبات إلى جيل P3 وما بعده ، بينما فشلت حالتان من عينات HNSCC في تكوين أورام بعد انتقالها إلى جيل P1. كانت معدلات نمو بعض العينات بطيئة نسبيا في جيل P0 ، ولكن تم تسريع معدلات نموها بعد انتقالها إلى P1 والأجيال اللاحقة. تمت مقارنة الخصائص النسيجية المرضية لأورام المريض مع تلك الخاصة بأجيال مختلفة من نماذج PDX. أظهرت النتائج أن أورام PDX والأورام الأولية المشتقة من المريض كانت متشابهة تقريبا من الناحية الشكلية (الشكل 3) ، مع اختلافات طفيفة قد تكون بسبب عدم التجانس في منطقة أخذ العينات بين المرضى والأجيال المختلفة من PDX.

تم تقييم الفعالية المضادة للورم من lenvatinib (مثبط التيروزين كيناز متعدد الأهداف المعتمد لعلاج سرطان الغدة الدرقية المتقدم28) في نموذج PDX من ATC. كما هو موضح في الشكل 4 أ ، فإن علاج لينفاتينيب يثبط بشكل كبير نمو الورم في نموذج ATC PDX مقارنة بمجموعة التحكم الملحية العادية (P < 0.05). في نهاية التجربة ، تم استئصال أنسجة الورم ووزنها لتحديد وزن الورم. بالمقارنة مع المجموعة الضابطة ، كان وزن الورم لمجموعة علاج lenvatinib أقل ، على الرغم من عدم تحقيق فرق إحصائي (الشكل 4B). بالإضافة إلى ذلك ، لم تلاحظ أي تغييرات واضحة في الحالة العامة ووزن الجسم في الفئران التي عولجت باللينفاتينيب (الشكل 4C). بسبب التكرار المفرط لإدارة سيسبلاتين أثناء التجارب ، أظهرت الفئران سمية كبيرة ، تتجلى في فقدان الوزن وحتى الموت. تظهر فعالية سيسبلاتين المضادة للورم في الشكل التكميلي 1.

Figure 1
الشكل 1: منحنى نمو الورم لنماذج ATC PDX من مرضى مختلفين. يمثل كل لون الجيل المحدد ، ويمثل كل منحنى ورما واحدا. تم تلقيح واحد إلى ثلاثة فئران في جيل الممر 0 (P0) ، وتم تلقيح خمسة فئران في الممرات اللاحقة (P1-P5). يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 2
الشكل 2: منحنى نمو الورم لنماذج HNSCC PDX من مرضى مختلفين. يمثل كل لون الجيل المحدد ، ويمثل كل منحنى ورما واحدا. تم تلقيح واحد إلى ثلاثة فئران في جيل P0 ، وتم تلقيح خمسة فئران في P1 والأجيال اللاحقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 3
الشكل 3: دراسة نسيجية مرضية. مقارنة نسيجية مرضية بين الأورام الأولية للمريض و PDXs المقابلة (المقطع 1 والممر 3) من ATC (THY-012 ، THY-017) و HNSCC (OTO-017) (تلطيخ الهيماتوكسيلين-يوزين ، 100x). كانت الأنواع الفرعية المرضية ل THY-012 و THY-017 عبارة عن سرطان الغدة الدرقية الكشمي ، وكان النوع الفرعي المرضي ل OTO-017 هو سرطان الخلايا الحرشفية. قضبان المقياس = 100 ميكرومتر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Figure 4
الشكل 4: الفعالية العلاجية للينفاتينيب في نموذج ATC PDX. التغيرات في (أ) حجم الورم ، (ب) وزن الورم ، و (ج) وزن الجسم للفئران الحاملة ل ATC PDX بعد العلاج باللينفاتينيب (10 مجم / كجم). تم إجراء التحليلات الإحصائية باستخدام اختبارات T لمقارنة ليفاتينيب مع السيطرة. * P < 0.05 مقابل السيطرة اعتبرت ذات دلالة إحصائية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

البارامترات فصل معدل أخذ الورم (٪) P
العمر (سنوات) <60 16.67 (1/6) 0.615
≥60 33.33 (4/12)
جنس ذكر 16.67 (1/6) 0.615
أنثى 33.33 (4/12)
قطر الورم <6 سم 37.50 (3/8) 0.608
≥6 سم 20.00 (2/10)
مرحلة TNM المرضية أنا 0.00 (0/1) 1
Ш 0.00 (0/1)
Equation 2 31.25 (5/16)
التمايز عال 0.00 (0/7) 0.059
فقير 25.00 (1/4)
غير متمايزة 57.14 (4/7)

الجدول 1: العلاقة بين معدل أخذ ورم ATC والخصائص السريرية للمرضى.

البارامترات فصل معدل أخذ الورم (٪) P
فيروس الورم الحليمي البشري سالب 33.33 (2/6) 1
غير معروف أو إيجابي 36.36 (4/11)
العمر (سنوات) <60 33.33 (3/9) 1
≥60 37.50 (3/8)
جنس ذكر 50.00 (5/10) 0.304
أنثى 14.29 (1/7)
حالة التدخين اي وقت مضي 44.44 (4/9) 0.62
أبدا 25.00 (2/8)
قطر الورم <3 سم 40.00 (4/10) 1
≥3 سم 28.57 (2/7)
مرحلة TNM المرضية أنا 75.00 (3/4) 0.423
Equation 1 25.00 (2/8)
Ш 0.00 (0/1)
Equation 2 33.33 (1/3)
ورم خبيث بعيد Y 28.57 (2/7) 0.633
N 44.44 (4/9)
التمايز عال 12.50 (1/8) 0.036*
متوسط إلى مرتفع 100.00 (2/2)
المعتدل 0.00 (0/2)
متوسط إلى ضعيف 66.67 (2/3)
* ف < 0.05

الجدول 2: العلاقة بين معدل أخذ الورم HNSCC والخصائص السريرية للمرضى. * P < 0.05.

اسم العينة الجيل P إلى P0 الجيل P0 إلى P1 الجيل P1 إلى P2 الجيل P2 إلى P3 الجيل P3 إلى P4 الجيل P4 إلى P5
ثي-004 68 87 29 34 28 26
ثي-012 119 61 66 55 87 116
ثي-017 27 17 30 13 22 15
ثي-018 134 70 48 48 - -
ثي-021 53 66 35 49 - -
OTO-017 118 86 67 129 - -
OTO-022 155 55 32 37 27 46
OTO-030 133 93 104 - - -
OTO-031 144 58 33 34 52 50

الجدول 3: متوسط دورة الورم (الوقت من التلقيح إلى حجم الورم 1000 مم3) لنماذج ATC و HNSCC.

الشكل التكميلي 1: الفعالية العلاجية للسيسبلاتين في نموذج ATC PDX. التغيرات في (أ) حجم الورم ، (ب) وزن الورم ، و (ج) وزن الجسم للفئران الحاملة ل ATC PDX بعد العلاج بالسيسبلاتين (3 مجم / كجم). تم إجراء التحليلات الإحصائية باستخدام اختبارات T لمقارنة سيسبلاتين مع السيطرة. * P < 0.05 مقابل السيطرة اعتبرت ذات دلالة إحصائية. الرجاء الضغط هنا لتنزيل هذا الملف.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

نجحت هذه الدراسة في إنشاء نماذج PDX تحت الجلد ل ATC و HNSCC. هناك العديد من الجوانب التي يجب الانتباه إليها أثناء عملية بناء نموذج PDX. عندما يتم فصل أنسجة الورم عن المريض ، يجب وضعها في صندوق الثلج وإرسالها إلى المختبر للتلقيح في أقرب وقت ممكن. بعد وصول الورم إلى المختبر ، يجب على المشغل الانتباه إلى الحفاظ على حقل معقم وممارسة الإجراءات المعقمة. بالنسبة لعينات الخزعة بالإبرة ، نظرا لأن أنسجة الورم صغيرة بشكل خاص ، فإن التلقيح بعد خلط العينة مع هلام المصفوفة سيكون أكثر ملاءمة لإنشاء النموذج. يجب أيضا الحفاظ على أنسجة الورم الأولية وتثبيتها وتجميدها قدر الإمكان للبحث في المستقبل. أثناء التلقيح ، يجب طرد الهواء الموجود في المبزل قدر الإمكان بعد وضع قطع الورم في المبزل قبل الاستخدام. بعد تلقيح الورم ، يجب ملاحظة نمو الورم في الفئران لمدة 1-4 أشهر ، ويمكن القتل الرحيم للفئران التي لا تنمو الورم لأكثر من 6 أشهر29.

يتم اختيار الفئران التي تعاني من نقص المناعة بشكل عام كمضيف لبناء نموذج PDX29,30. من جيل P0 إلى جيل P2 ، يتم استخدام الفئران غير المصابة بالسمنة المفرطة والسكرية التي تعاني من نقص المناعة الشديد (NOD-SCID) أو الفئران NOD Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl / SzJ (NSG) بشكل عام. في جيل P3 وما بعده ، تعتبر العينات قد تم تمريرها بثبات ، لذلك يمكن للفئران العارية عادة أن تعمل أيضا كمضيف ، ويمكن أن تنمو الأورام أيضا بشكل طبيعي. بالإضافة إلى ذلك ، ارتبط كل من إجمالي وقت العملية ، ووقت عزل الورم ، والبقاء على قيد الحياة بدون أمراض ، ومعدل البقاء الإجمالي للمرضى ، والدرجة الخبيثة للورم ، والنوع الفرعي النسيجي بورم نموذج PDX31،32،33،34. يؤثر موقع الزرع أيضا على معدل نجاح نمذجة PDX ، وقد أظهرت الدراسات أن الكبسولة الكلوية وزرع تقويم العظام لهما معدل ورم مرتفع33,35. بالإضافة إلى ذلك ، قد يؤدي استخدام Matrigel أيضا إلى تحسين معدل الورم36,37. تم الإبلاغ عن أن عدوى فيروس الورم الحليمي البشري (HPV) تؤثر على معدل نجاح الزرع في أورام HNSCC. الأورام السلبية لفيروس الورم الحليمي البشري لها معدل أخذ أعلى مقارنة بالأورام الإيجابية لفيروس الورم الحليمي البشري38,39. لم تصل هذه الدراسة إلى نفس النتيجة ، ربما بسبب أعداد العينات الصغيرة والمعلومات غير الكاملة عن عدوى فيروس الورم الحليمي البشري.

يختلف النموذج تحت الجلد عن نماذج زرع الكبسولة التقويمية والكلوية ، وهو أكثر ملاءمة لمراقبة نمو الأورام ويساعد أيضا على تشغيل40،41،42. استنادا إلى بيانات نمو الورم لنموذج ATC و HNSCC PDX ، وجدنا أن معدلات نمو الأورام من مرضى مختلفين كانت غير متسقة ، مما يعكس عدم التجانس بين الأورام. كان معدل نمو الورم لجيل P0 من معظم نماذج PDX أبطأ نسبيا من الممرات الأخيرة ، والذي كان على الأرجح بسبب تكيف البيئة المكروية للفأر. والجدير بالذكر أن معدل النمو من بعض الأورام المشتقة من المريض زاد في مقاطع مختلفة بعد جيل P1 ، بما يتفق مع فترة المرور المختصرة التي أبلغ عنها Pearson et al.43. أظهر الفحص النسيجي المرضي أن أورام PDX احتفظت بالخصائص المورفولوجية للأورام الأولية. انعكست العلاقة بين نموذج PDX ومرضى ATC السريريين أيضا في نتائج الاختبارات الدوائية في الجسم الحي ، والتي أظهرت أن Lenvartinib أظهر تأثيرا جيدا مضادا للورم ، بما يتفق مع التقارير السريرية25،26،27.

ومع ذلك ، فإن نموذج PDX له أيضا عيوب معينة. على سبيل المثال ، وقت تكوين الورم طويل نسبيا ، وهو غير مناسب للمرضى الذين يعانون من أورام متقدمة أو عدوانية. بالإضافة إلى ذلك ، فإن الوقت والتكاليف النقدية لفحص المخدرات عالية الإنتاجية مرتفعة للغاية44. في الواقع ، فإن الجمع بين نموذج PDX وعضويات الورم وإنشاء نموذج عضوي مشتق من المريض (PDO) يتوافق مع نموذج PDX من شأنه أن يعوض عن هذا النقص 44،45،46. يمكن استخدام نماذج زرع تقويم العظام لدراسة التسبب في الأورام والآليات النقيلية للأورام40،41،47. يعد عدم وجود نظام مناعي وظيفي عيبا آخر لنموذج PDX ، لذلك تستخدم أعداد متزايدة من التجارب الفئران المتوافقة مع البشر لبناء نموذج PDX لأبحاث المناعة السرطانية48،49،50.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

لا يتم الكشف عن أي تضارب محتمل في المصالح.

Acknowledgments

تم دعم هذا العمل من قبل برنامج دعم العلوم والتكنولوجيا في مقاطعة سيتشوان (رقم المنحة 2019JDRC0019 و 2021ZYD0097) ، ومشروع 1.3.5 لتخصصات التميز ، مستشفى غرب الصين ، جامعة سيتشوان (رقم المنحة ZYJC18026) ، مشروع 1.3.5 لتخصصات التميز - مشروع حضانة البحوث السريرية ، مستشفى غرب الصين ، جامعة سيتشوان (المنحة رقم 2020HXFH023) ، صناديق البحوث الأساسية للجامعات المركزية (SCU2022D025) ، مشروع التعاون الدولي لمكتب تشنغدو للعلوم والتكنولوجيا (المنحة رقم 2022-GH02-00023-HZ) ، ومشروع شرارة الابتكار بجامعة سيتشوان (المنحة رقم 2019SCUH0015) ، وصندوق تدريب المواهب للتكامل الطبي الهندسي لمستشفى غرب الصين - جامعة العلوم والتكنولوجيا الإلكترونية (رقم المنحة. HXDZ22012).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2.4 mm x 2.0 mm trocar Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd 18-9065
Balb/c nude mice Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. 401
Biosafety cabinet Suzhou Antai BSC-1300IIA2
Blade Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd 18-0823
Centrifuge tube  Corning 430791/430829
Cryopreservation tube Chengdu Dianrui Experimental Instrument Co., Ltd /
Custodiol HTK-Solution Custodiol 2103417
Dimethyl sulfoxide(DMSO) SIGMA-ALORICH D5879-500mL
Electronic balance METTLER ME104
Electronic digital caliper Chengdu Chengliang Tool Group Co., Ltd 0-220
fetal bovine serum(FBS) VivaCell C04001-500
IBM SPSS Statistics 26 IBM
Ketamine Jiangsu Zhongmu Beikang Pharmaceutical Co., Ltd  100761663
Lenvatinib ApexBio A2174
NOD-SCID immunodeficient mice Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. 406
Pen-Strep Solution Biological Industries 03-03101BCS
Petri dish WHB WHB-60/WHB-100
Saline  Sichuan Kelun W220051705
Scissor Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd 18-0110
Tweezer Shenzhen Huayang Biotechnology Co., Ltd 18-1241
Vet ointment Pfizer Inc. P10015353
Xylazine Dunhua Shengda Animal Medicine Co., Ltd 070031777

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Toolan, H. W. Successful subcutaneous growth and transplantation of human tumors in X-irradiated laboratory animals. Proceedings of The Society for Experimental Biology and Medicine. 77 (3), 572-578 (1951).
  2. Gillet, J. P., et al. Redefining the relevance of established cancer cell lines to the study of mechanisms of clinical anti-cancer drug resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (46), 18708-18713 (2011).
  3. Hausser, H. J., Brenner, R. E. Phenotypic instability of Saos-2 cells in long-term culture. Biochemical & Biophysical Research Communications. 333 (1), 216-222 (2005).
  4. Pérez-Mancera, P., Guerra, C., Barbacid, M., Tuvesonet, D. A. What we have learned about pancreatic cancer from mouse models. Gastroenterology. 142 (5), 1079-1092 (2012).
  5. Bruna, A., et al. A biobank of breast cancer explants with preserved intra-tumor heterogeneity to screen anticancer compounds. Cell. 167 (1), 260-274 (2016).
  6. Choi, S., et al. Lessons from patient-derived xenografts for better in vitro modeling of human cancer. Advanced Drug Delivery Reviews. 79-80, 222-237 (2014).
  7. Blomme, A., et al. Murine stroma adopts a human-like metabolic phenotype in the PDX model of colorectal cancer and liver metastases. Oncogene. 37 (9), 1237-1250 (2018).
  8. Wang, D., et al. Molecular heterogeneity of non-small cell lung carcinoma patient-derived xenografts closely reflect their primary tumors. International Journal of Cancer. 140 (3), 662-673 (2016).
  9. Jung, J., et al. Generation and molecular characterization of pancreatic cancer patient-derived xenografts reveals their heterologous nature. Oncotarget. 7 (38), 62533-62546 (2016).
  10. Keysar, S., et al. A patient tumor transplant model of squamous cell cancer identifies PI3K inhibitors as candidate therapeutics in defined molecular bins. Molecular Oncology. 7 (4), 776-790 (2013).
  11. Rubio-Viqueira, B., et al. An in vivo platform for translational drug development in pancreatic cancer. Clinical Cancer Research. 12 (15), 4652-4661 (2006).
  12. Fiebig, H. H., et al. Development of three human small cell lung cancer models in nude mice. Recent Results in Cancer Research. 97, 77-86 (1985).
  13. Morelli, M. P., et al. Prioritizing phase I treatment options through preclinical testing on personalized tumorgraft. Journal of Clinical Oncology. 30 (4), 45-48 (2012).
  14. Bray, F., et al. Global cancer statistics 2018: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries. CA. 68 (6), 394-424 (2018).
  15. Onoda, N., et al. Evaluation of the 8th edition TNM classification for anaplastic thyroid carcinoma. Cancers. 12 (3), 552 (2020).
  16. Nel, C., et al. Anaplastic carcinoma of the thyroid: A clinicopathologic study of 82 cases. Mayo Clinic Proceedings. 60 (1), 51-58 (1985).
  17. Mazzaferri, E. L. Increasing incidence of thyroid cancer in the United States, 1973-2002. Yearbook of Medicine. 2007, 496-499 (2007).
  18. Kebebew, E., Greenspan, F. S., Clark, O. H., Woeber, K. A., Mcmillan, A. Anaplastic thyroid carcinoma. Treatment outcome and prognostic factors. Cancer. 103 (7), 1330-1335 (2005).
  19. Lin, B., et al. The incidence and survival analysis for anaplastic thyroid cancer: A SEER database analysis. American Journal of Translational Research. 11 (9), 5888-5896 (2019).
  20. Maniakas, A., Dadu, R., Busaidy, N. L., Wang, J. R., Zafereo, M. Evaluation of overall survival in patients with anaplastic thyroid carcinoma, 2000-2019. JAMA Oncology. 6 (9), 1397-1404 (2020).
  21. Gilardi, M., et al. Tipifarnib as a precision therapy for HRAS-mutant head and neck squamous cell carcinomas. Molecular Cancer Therapeutics. 19 (9), 1784-1796 (2020).
  22. Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. Cancer statistics, 2016. CA. 66 (1), 7-30 (2016).
  23. Chow, L. Q. M. Head and neck cancer. New England Journal of Medicine. 382 (1), 60-72 (2020).
  24. Swiecicki, P. L., Brennan, J. R., Mierzwa, M., Spector, M. E., Brenner, J. C. Head and neck squamous cell carcinoma detection and surveillance: Advances of liquid biomarkers. Laryngoscope. 129 (8), 1836-1843 (2019).
  25. Wang, R., et al. Distribution and activity of lenvatinib in brain tumor models of human anaplastic thyroid cancer cells in severe combined immune deficient mice. Molecular Cancer Therapeutics. 18 (5), 947-956 (2019).
  26. Takahashi, S., et al. A phase II study of the safety and efficacy of lenvatinib in patients with advanced thyroid cancer. Future Oncology. 15 (7), 717-726 (2019).
  27. Ferrari, S. M., et al. Lenvatinib exhibits antineoplastic activity in anaplastic thyroid cancer in vitro and in vivo. Oncology Reports. 39 (5), 2225-2234 (2018).
  28. Cabanillas, M. E., Habra, M. A. Lenvatinib: Role in thyroid cancer and other solid tumors. Cancer Treatment Reviews. 42, 47-55 (2016).
  29. Jung, J., Seol, H. S., Chang, S. The generation and application of patient-derived xenograft model for cancer research. Cancer Research and Treatment. 50 (1), 1-10 (2018).
  30. Peng, S., et al. Tumor grafts derived from patients with head and neck squamous carcinoma authentically maintain the molecular and histologic characteristics of human cancers. Journal of Translational Medicine. 11, 198 (2013).
  31. Derose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nature Medicine. 17 (11), 1514-1520 (2011).
  32. Chen, X., Shen, C., Wei, Z., Zhang, R., Xiao, K. Patient-derived non-small cell lung cancer xenograft mirrors complex tumor heterogeneity. Cancer Biology and Medicine. 18 (1), 184-198 (2021).
  33. Choi, Y. Y., et al. Establishment and characterisation of patient-derived xenografts as paraclinical models for gastric cancer. Scientific Reports. 6, 22172 (2016).
  34. Maider, I. V., Andrés, C., Alberto, B. Preclinical models for precision oncology. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Reviews on Cancer. 1872 (2), 239-246 (2018).
  35. Okada, S., Vaeteewoottacharn, K., Kariya, R. Establishment of a patient-derived tumor xenograft model and application for precision cancer medicine. Chemical & Pharmaceutical Bulletin. 66 (3), 225-230 (2018).
  36. Michael, G., et al. Tumor take rate optimization for colorectal carcinoma patient-derived xenograft models. BioMed Research International. 2016, 1715053 (2016).
  37. Bernardo, C., Costa, C., Sousa, N., Amado, F., Santos, L. Patient-derived bladder cancer xenografts: a systematic review. Translational Research. 166 (4), 324-331 (2015).
  38. Facompre, N. D., et al. Barriers to generating PDX models of HPV-related head and neck. Laryngoscope. 127 (12), 2777-2783 (2017).
  39. Kang, H. N., Kim, J. H., Park, A. Y., Choi, J. W., Kim, H. R. Establishment and characterization of patient-derived xenografts as paraclinical models for head and neck cancer. BMC Cancer. 20 (1), 316 (2020).
  40. Ahn, S. H., et al. An orthotopic model of papillary thyroid carcinoma in athymic nude mice. Archives of Otolaryngology-Head & Neck Surgery. 134 (2), 190-197 (2008).
  41. Nucera, C., et al. A novel orthotopic mouse model of human anaplastic thyroid carcinoma. Thyroid. 19 (10), 1077-1084 (2009).
  42. De Rose, F., et al. Galectin-3 targeting in thyroid orthotopic tumors opens new ways to characterize thyroid cancer. Journal of Nuclear Medicine. 60 (6), 770-776 (2019).
  43. Pearson, A. T., et al. Patient-derived xenograft (PDX) tumors increase growth rate with time. Oncotarget. 7 (7), 7993-8005 (2016).
  44. Huo, K. G., D'Arcangelo, E., Tsao, M. S. Patient-derived cell line, xenograft and organoid models in lung cancer therapy. Translational Lung Cancer Research. 9 (5), 2214-2232 (2020).
  45. Kumari, R., Xu, X., Li, H. Q. Translational and clinical relevance of PDX-derived organoid models in oncology drug discovery and development. Current Protocols. 2 (7), e431 (2022).
  46. Takahashi, N., et al. Construction of in vitro patient-derived tumor models to evaluate anticancer agents and cancer immunotherapy. Oncology Letters. 21 (5), 406 (2021).
  47. Barasch, A., et al. Photobiomodulation effects on head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) in an orthotopic animal model. Supportive Care in Cancer. 28 (6), 2721-2727 (2020).
  48. Wang, M., et al. Humanized mice in studying efficacy and mechanisms of PD-1-targeted cancer immunotherapy. FASEB Journal. 32 (3), 1537-1549 (2018).
  49. Wu, C., Wang, X., Shang, H., Wei, H. Construction of a humanized PBMC-PDX model to study the efficacy of a bacterial marker in lung cancer immunotherapy. Disease Markers. 2022, 1479246 (2022).
  50. Yao, L. C., et al. Creation of PDX-bearing humanized mice to study immuno-oncology. Methods in Molecular Biology. 1953, 241-252 (2019).

Tags

أبحاث السرطان ، العدد 196 ،
إنشاء وتوصيف نماذج الطعم الخارجي المشتقة من المريض لسرطان الغدة الدرقية الكشمي وسرطان الخلايا الحرشفية في الرأس والرقبة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Wu, M., Liu, Y., Zhao, Y., Zhang,… More

Wu, M., Liu, Y., Zhao, Y., Zhang, Y., Huang, L., Du, Q., Zhang, T., Zhong, Z., Luo, H., Xiao, K. Establishment and Characterization of Patient-Derived Xenograft Models of Anaplastic Thyroid Carcinoma and Head and Neck Squamous Cell Carcinoma. J. Vis. Exp. (196), e64623, doi:10.3791/64623 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter