माइक्रोवैस्कुलर टुकड़ों से संवहनी थर्मोजेनिक वसा ऊतक की त्रि-आयामी संस्कृति

Summary

यहां, हम कृंतक या मानव वसा ऊतक से अलग माइक्रोवैस्कुलर टुकड़ों के उपयोग को रेखांकित करते हुए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं जो कार्यात्मक, संवहनी बेज वसा ऊतक को इंजीनियर करने के लिए एक सीधा दृष्टिकोण है।

Abstract

इंजीनियरिंग थर्मोजेनिक वसा ऊतक (जैसे, बेज या भूरे रंग के वसा ऊतक) की जांच चयापचय रोगों के लिए संभावित चिकित्सा के रूप में या स्वास्थ्य स्क्रीनिंग और दवा परीक्षण के लिए व्यक्तिगत सूक्ष्म ऊतकों के डिजाइन के लिए की गई है। वर्तमान रणनीतियाँ अक्सर काफी जटिल होती हैं और थर्मोजेनिक वसा ऊतक के बहुकोशिकीय और कार्यात्मक गुणों को पूरी तरह से चित्रित करने में विफल रहती हैं। माइक्रोवैस्कुलर टुकड़े, छोटे बरकरार माइक्रोवाइल जिनमें धमनशी, शिराएं और वसा ऊतक से अलग केशिकाएं शामिल हैं, कोशिकाओं के एकल ऑटोलॉगस स्रोत के रूप में काम करते हैं जो वैस्कुलराइजेशन और वसा ऊतक गठन को सक्षम करते हैं। यह लेख माइक्रोवैस्कुलर टुकड़ों से त्रि-आयामी, संवहनी और कार्यात्मक थर्मोजेनिक वसा ऊतकों की पीढ़ी को सक्षम करने के लिए संस्कृति की स्थितियों को अनुकूलित करने के तरीकों का वर्णन करता है, जिसमें वसा ऊतक और संस्कृति स्थितियों से माइक्रोवस्कुलर टुकड़ों को अलग करने के लिए प्रोटोकॉल शामिल हैं। इसके अतिरिक्त, सर्वोत्तम प्रथाओं पर चर्चा की जाती है, जैसा कि इंजीनियर ऊतकों को चिह्नित करने के लिए तकनीकें हैं, और कृंतक और मानव माइक्रोवैस्कुलर टुकड़े दोनों से नमूना परिणाम प्रदान किए जाते हैं। इस दृष्टिकोण में मोटापे और चयापचय रोग के लिए उपचार की समझ और विकास के लिए उपयोग किए जाने की क्षमता है।

Introduction

इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य एक एकल, संभावित ऑटोलॉगस स्रोत, माइक्रोवैस्कुलर टुकड़ा (एमवीएफ) से संवहनी बेज वसा ऊतक विकसित करने के लिए एक दृष्टिकोण का वर्णन करना है। ब्राउन और बेज वसा ऊतकों को चयापचय विनियमन से संबंधित लाभकारी गुणों को प्रदर्शित करने के लिए प्रदर्शित किया गया है; हालांकि, वयस्कों में इन वसा ऊतक डिपो की छोटी मात्रा प्रणालीगत चयापचय पर संभावित प्रभाव को सीमित करती है, विशेष रूप से मोटापे या टाइप 2 मधुमेह 1,2,3,4,5,6,7 जैसी रोगग्रस्त स्थितियों में। मोटापे और इसकी कोमोर्बिडिटी 8,9,10,11,12 से जुड़े हानिकारक चयापचय प्रभावों को रोकने के लिए एक चिकित्सीय लक्ष्य के रूप में भूरे / बेज वसा में महत्वपूर्ण रुचि है।

एमवीएफ पोत संरचनाएं हैं जिन्हें वसा ऊतक से सीधे अलग किया जा सकता है, सुसंस्कृत किया जा सकता है, और ^13,14,15 की विस्तारित अवधि के लिए त्रि-आयामी विन्यास में बनाए रखा जा सकता है। हमारे समूह और अन्य लोगों के पिछले काम ने एमवीएफ की बहुकोशिकीय और मल्टीपोटेंट क्षमता का फायदा उठाना शुरू कर दिया है, विशेष रूप से क्योंकि यह वसा ऊतक गठन^16,17,18 से संबंधित है। इस काम के निर्माण के रूप में, हमने हाल ही में प्रदर्शित किया कि स्वस्थ और टाइप 2 मधुमेह¹⁹ के कृंतक मॉडल और मानव विषयों (50 वर्ष से अधिक आयु के वयस्कों) ²⁰ से प्राप्त एमवीएफ में थर्मोजेनिक, या बेज, वसा ऊतक बनाने के लिए प्रेरित होने में सक्षम कोशिकाएं थीं।

इसमें एक अभिनव दृष्टिकोण है जिसमें से एक एकल स्रोत एमवीएफ का उपयोग किया जाता है, न केवल बेज वसा ऊतक बनाने में सक्षम है, बल्कि इसके संबंधित और महत्वपूर्ण संवहनी घटक²¹ भी हैं। थर्मोजेनिक वसा ऊतक गठन के लिए एक सरल ऊतक-इंजीनियर दृष्टिकोण की तलाश में अध्ययन के लिए इस तकनीक का उपयोग बहुत महत्वपूर्ण हो सकता है। बेज वसा ऊतक 22,23,24,25,26,27,28 को इंजीनियर करने के इच्छुक अन्य तरीकों के विपरीत^, इस अध्ययन में वर्णित प्रक्रिया को कई सेल प्रकारों या जटिल प्रेरण आहार का उपयोग करने की आवश्यकता नहीं है। संवहनी बेज और सफेद वसा मॉडल कृंतक और मानव स्रोतों से उत्पन्न एमवीएफ के साथ बनाए जा सकते हैं, जो महान अनुवाद क्षमता का प्रदर्शन करते हैं। इस प्रोटोकॉल का अंतिम उत्पाद भूरे रंग के वसा ऊतक की तुलना में संरचना और चयापचय समारोह के साथ एक इंजीनियर बेज थर्मोजेनिक वसा ऊतक है। कुल मिलाकर, यह प्रोटोकॉल इस विचार को प्रस्तुत करता है कि एक आसानी से सुलभ और संभवतः ऑटोलॉगस स्रोत एमवीएफ चयापचय संबंधी विकारों का अध्ययन करने के लिए एक सार्थक चिकित्सीय हस्तक्षेप और उपकरण हो सकता है।

Protocol

यह अध्ययन प्रयोगशाला पशुओं की देखभाल और उपयोग के लिए गाइड के सिद्धांतों के अनुसार पशु कल्याण अधिनियम और कार्यान्वयन पशु कल्याण विनियमों के अनुपालन में आयोजित किया गया था। सैन एंटोनियो में टेक्सास वि…

Representative Results

भूरे रंग के वसा ऊतक की कुछ प्रमुख फेनोटाइपिक रूपात्मक विशेषताएं हैं: यह बहुकोणीय / इसमें छोटे लिपिड बूंदें होती हैं, बड़ी संख्या में माइटोकॉन्ड्रिया होते हैं (विवो में इसकी विशिष्ट रूप से “भूरा” उपस्थित…

Discussion

बेज वसा ऊतक इंजीनियरिंग का क्षेत्र काफी हद तक अपरिपक्व है 22,23,24,25,26,27,28, जिसमें सफेद वसा ऊतक ^8,22,31 के लिए वसा मॉडल का बड़ा हिस्सा विकसित किया जा रहा है?…

Materials

Aminocaproic Acid	Sigma Aldrich	A2504-100G	Added in DMEM at the concentration of 1 mg/mL
Blunt-Tipped Scissors	Fisher scientific	12-000-172	Sterilize in autoclave
Bovin Serum Albumin (BSA)	Millipore	126575-10GM	Diluted in PBS to 4 mg/mL and 1 mg/mL
Collagenase Type 1	Fisher scientific	NC9633623	Diluted to 6 mg/mL in BSA 4 mg/mL, Digestion of minced fat
Dexamethasone	Thermo Scientific	AC230302500	Diluted in ethanol at a 2 mg/ml stock concentration
Disposable underpads	Fisher scientific	23-666-062	For fluid absorption during surgery
Dissecting Scissors	Fisher scientific	08-951-5	Sterilize in autoclave
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium (DMEM)	Fisher scientific	11885092
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM/F12)	Sigma Aldrich	D8062
Fetal Bovine Serum	Fisher scientific	16140089	Added in DMEM to 20% v/v.
Fibrinogen	Sigma Aldrich	F8630-25G	Solubilized in DMEM at the concentration of 20 mg/mL, Protein found in blood plasma and main component of hydrogel
Flask, 250 mL	Fisher scientific	FB500250	Allows for digestion of fat using a large surface area
Forceps	Fisher scientific	50-264-21	Sterilize in autoclave, For handling of tissue and filters
Forskolin	Sigma Aldrich	F6886	Diluted in ethanol at a 10 mM stock concentration
Human MVF	Advanced Solutions Life Scienes, LLC	https://www.advancedsolutions.com/microvessels	Human MVFs (hMVFs) isolated from three different patients (52-, 54-, and 56-year old females) were used in the current study.
Indomethacine	Sigma Aldrich	I7378	Diluted in ethanol at a 12.5 mM stock concentration
Insulin from porcine pancreas	Sigma Aldrich	I5523	Diluted in 0.01 N HCl at a 5 mg/ml stock concentration
MycoZap	Fisher scientific	NC9023832	Added in DMEM to 0.2% w/v, Mycoplasma Prophylactic
Pennycilin/Streptomycin (10,000 U/mL)	Fisher scientific	15140122	Added in DMEM to 1% v/v.
Petri dishes, polystyrene (100 mm x 15 mm).	Fisher scientific	351029	3 for removal of blood vessels and mincing, 8 (lid) for presoaking of screens & 8 (dish) for use when filtering with 500 or 37 µM screens
Petri dishes, polystyrene (35 mm x 10 mm).	Fisher scientific	50-202-036	For counting fragments
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Fisher scientific	14-190-250	Diluted to 1x with sterile deionized water.
Rat Clippers (Andwin Mini Arco Pet Trimmer)	Fisher scientific	NC0854141
Rosiglitazone	Fisher scientific	R0106200MG	Diluted in DMSO at a 10 mM stock concentration
Scissors	Fine Science Tools	14059-11	1 for initial incision, 1 for epididymal incision, 1 for tip clipping
Screen  37 µM	Carolina Biological Supply Company	652222R	Cut into 3" rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Fragment entrapment and removal of very small fragments/single cells and debris
Screen 500 µM	Carolina Biological Supply Company	652222F	Cut into 3" rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Removes larger fragments/debris
Serrated Hemostat	Fisher scientific	12-000-171	Sterilize in autoclave, For clamping of skin before incision
Steriflip Filter 0.22 μm	Millipore	SE1M179M6
Thrombin	Fisher scientific	6051601KU	Diluted in deionzed water to 10 U/mL, Used as a clotting agent turning fibrinogen to fibrin
Thyroid hormone (T3)	Sigma Aldrich	T2877	Diluted in 1N NaOH at a 0.02 mM stock concentration
Zucker diabetic fatty (ZDF) rats – obese (FA/FA) or lean (FA/+) male	Charles River	https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-lean-fa?region=3611 https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-obese?region=3611	Obtained from Charles River (Wilmington, MA). Rats were acquired at 4 weeks of age and fed Purina 5008 until euthanasia (15-19 weeks of age). Glucose levels (blood from the lateral saphenous vein) were greater than 300 mg/dL in all FA/FA rats used in the study. All animals were housed in a temperature-controlled environment with a 12-h light-dark cycle and fed ad libitum.