Burada, kemirgen veya insan yağ dokusundan izole edilen mikrovasküler fragmanların işlevsel, vaskülarize bej yağ dokusunun mühendisliğine basit bir yaklaşım olarak kullanımını özetleyen ayrıntılı bir protokol sunuyoruz.
Mühendislik termojenik yağ dokusu (örneğin, bej veya kahverengi yağ dokuları), metabolik hastalıklar için potansiyel bir tedavi olarak veya sağlık taraması ve ilaç testi için kişiselleştirilmiş mikrodokuların tasarımı için araştırılmıştır. Mevcut stratejiler genellikle oldukça karmaşıktır ve termojenik yağ dokusunun çok hücreli ve fonksiyonel özelliklerini tam olarak tam olarak tasvir edememektedir. Yağ dokusundan izole edilen arteriol, venüller ve kılcal damarlardan oluşan küçük bozulmamış mikrodamarlar olan mikrovasküler fragmanlar, vaskülarizasyon ve yağ dokusu oluşumunu sağlayan tek bir otolog hücre kaynağı olarak işlev görür. Bu makalede, mikrovasküler fragmanların yağ dokusu ve kültür koşullarından izole edilmesine yönelik protokoller de dahil olmak üzere, mikrovasküler fragmanlardan üç boyutlu, vaskülarize ve fonksiyonel termojenik yağ dokularının üretilmesini sağlamak için kültür koşullarını optimize etme yöntemleri açıklanmaktadır. Ek olarak, mühendislik dokularını karakterize etme teknikleri gibi en iyi uygulamalar tartışılmakta ve hem kemirgen hem de insan mikrovasküler fragmanlarından numune sonuçları sağlanmaktadır. Bu yaklaşım, obezite ve metabolik hastalıklara yönelik tedavilerin anlaşılması ve geliştirilmesi için kullanılma potansiyeline sahiptir.
Bu protokolün amacı, potansiyel olarak otolog tek bir kaynaktan, mikrovasküler fragmandan (MVF) vaskülarize bej yağ dokusu geliştirmek için bir yaklaşımı tanımlamaktır. Kahverengi ve bej yağ dokularının metabolik regülasyon ile ilgili faydalı özellikler gösterdiği gösterilmiştir; Bununla birlikte, yetişkinlerde bu yağ dokusu depolarının küçük hacmi, özellikle obezite veya tip 2 diyabet 1,2,3,4,5,6,7 gibi hastalıklı durumlarda, sistemik metabolizma üzerindeki potansiyel etkiyi sınırlar. Obezite ve komorbiditeleri ile bağlantılı zararlı metabolik etkilerin önlenmesinde terapötik bir hedef olarak kahverengi / bej yağa önemli bir ilgi vardır 8,9,10,11,12.
MVF’ler, yağ dokusundan doğrudan izole edilebilen, kültürlenebilen ve uzun süre üç boyutlu bir konfigürasyonda tutulabilen damar yapılarıdır13,14,15. Grubumuzun ve diğerlerinin önceki çalışmaları, MVF’lerin çok hücreli ve çok güçlü kapasitesini, özellikle yağ dokusu oluşumu16,17,18 ile ilgili olarak kullanmaya başlamıştır. Bu çalışmanın bir birikimi olarak, yakın zamanda sağlıklı ve tip 2 diyabet19’un kemirgen modellerinden ve insan deneklerden (50 yaşın üzerindeki yetişkinler)20 türetilen MVF’lerin, termojenik veya bej yağ dokusu oluşturmak için indüklenebilen hücreler içerdiğini gösterdik.
Burada, sadece bej yağ dokusu oluşturmakla kalmayıp aynı zamanda ilişkili ve kritik vasküler bileşenini de oluşturabilen tek bir kaynak MVF’nin kullanıldığı yenilikçi bir yaklaşımbulunmaktadır 21. Bu tekniğin kullanımı, termojenik yağ dokusu oluşumu için basit bir doku mühendisliği yaklaşımı arayan çalışmalar için büyük değer taşıyabilir. Bej yağ dokusu 22,23,24,25,26,27,28’in mühendisliğini amaçlayan diğer yöntemlerin aksine, bu çalışmada açıklanan süreç çoklu hücre tiplerinin veya karmaşık indüksiyon rejimlerinin kullanılmasını gerektirmez. Kemirgen ve insan kaynaklarından kaynaklanan MVF’ler ile vaskülarize bej ve beyaz yağ modelleri oluşturulabilir ve bu da büyük çeviri potansiyeli gösterir. Bu protokolün son ürünü, kahverengi yağ dokusu ile karşılaştırılabilir bir yapıya ve metabolik fonksiyona sahip, tasarlanmış bir bej termojenik yağ dokusudur. Genel olarak, bu protokol, kolayca erişilebilen ve muhtemelen otolog bir kaynak MVF’nin metabolik bozuklukları incelemek için değerli bir terapötik müdahale ve araç olabileceği fikrini sunmaktadır.
Kahverengi/bej yağ dokusu mühendisliği alanı büyük ölçüde olgunlaşmamış 22,23,24,25,26,27,28 olup, beyaz yağ dokusu için yağ modellerinin büyük kısmıgeliştirilmektedir 8,22,31. M…
The authors have nothing to disclose.
Dr. Acosta, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından CA148724 ve TL1TR002647 hibeleri ile desteklenmektedir. Dr. Gonzalez Porras, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Diyabet ve Sindirim ve Böbrek Hastalıkları Enstitüsü tarafından F32-0DK122754 Ödül Numarası altında desteklenmektedir. Bu çalışma, kısmen, Ulusal Sağlık Enstitüleri (5SC1DK122578) ve San Antonio’daki Teksas Üniversitesi Biyomedikal Mühendisliği Bölümü tarafından desteklenmiştir. İçerik yalnızca yazarların sorumluluğundadır ve Ulusal Sağlık Enstitüleri’nin resmi görüşlerini temsil etmek zorunda değildir. Rakamlar kısmen Biorender.com ile oluşturulmuştur.
Aminocaproic Acid | Sigma Aldrich | A2504-100G | Added in DMEM at the concentration of 1 mg/mL |
Blunt-Tipped Scissors | Fisher scientific | 12-000-172 | Sterilize in autoclave |
Bovin Serum Albumin (BSA) | Millipore | 126575-10GM | Diluted in PBS to 4 mg/mL and 1 mg/mL |
Collagenase Type 1 | Fisher scientific | NC9633623 | Diluted to 6 mg/mL in BSA 4 mg/mL, Digestion of minced fat |
Dexamethasone | Thermo Scientific | AC230302500 | Diluted in ethanol at a 2 mg/ml stock concentration |
Disposable underpads | Fisher scientific | 23-666-062 | For fluid absorption during surgery |
Dissecting Scissors | Fisher scientific | 08-951-5 | Sterilize in autoclave |
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium (DMEM) | Fisher scientific | 11885092 | |
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM/F12) | Sigma Aldrich | D8062 | |
Fetal Bovine Serum | Fisher scientific | 16140089 | Added in DMEM to 20% v/v. |
Fibrinogen | Sigma Aldrich | F8630-25G | Solubilized in DMEM at the concentration of 20 mg/mL, Protein found in blood plasma and main component of hydrogel |
Flask, 250 mL | Fisher scientific | FB500250 | Allows for digestion of fat using a large surface area |
Forceps | Fisher scientific | 50-264-21 | Sterilize in autoclave, For handling of tissue and filters |
Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | Diluted in ethanol at a 10 mM stock concentration |
Human MVF | Advanced Solutions Life Scienes, LLC | https://www.advancedsolutions.com/microvessels | Human MVFs (hMVFs) isolated from three different patients (52-, 54-, and 56-year old females) were used in the current study. |
Indomethacine | Sigma Aldrich | I7378 | Diluted in ethanol at a 12.5 mM stock concentration |
Insulin from porcine pancreas | Sigma Aldrich | I5523 | Diluted in 0.01 N HCl at a 5 mg/ml stock concentration |
MycoZap | Fisher scientific | NC9023832 | Added in DMEM to 0.2% w/v, Mycoplasma Prophylactic |
Pennycilin/Streptomycin (10,000 U/mL) | Fisher scientific | 15140122 | Added in DMEM to 1% v/v. |
Petri dishes, polystyrene (100 mm x 15 mm). | Fisher scientific | 351029 | 3 for removal of blood vessels and mincing, 8 (lid) for presoaking of screens & 8 (dish) for use when filtering with 500 or 37 µM screens |
Petri dishes, polystyrene (35 mm x 10 mm). | Fisher scientific | 50-202-036 | For counting fragments |
Phosphate Buffer Saline (PBS) | Fisher scientific | 14-190-250 | Diluted to 1x with sterile deionized water. |
Rat Clippers (Andwin Mini Arco Pet Trimmer) | Fisher scientific | NC0854141 | |
Rosiglitazone | Fisher scientific | R0106200MG | Diluted in DMSO at a 10 mM stock concentration |
Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | 1 for initial incision, 1 for epididymal incision, 1 for tip clipping |
Screen 37 µM | Carolina Biological Supply Company | 652222R | Cut into 3" rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Fragment entrapment and removal of very small fragments/single cells and debris |
Screen 500 µM | Carolina Biological Supply Company | 652222F | Cut into 3" rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Removes larger fragments/debris |
Serrated Hemostat | Fisher scientific | 12-000-171 | Sterilize in autoclave, For clamping of skin before incision |
Steriflip Filter 0.22 μm | Millipore | SE1M179M6 | |
Thrombin | Fisher scientific | 6051601KU | Diluted in deionzed water to 10 U/mL, Used as a clotting agent turning fibrinogen to fibrin |
Thyroid hormone (T3) | Sigma Aldrich | T2877 | Diluted in 1N NaOH at a 0.02 mM stock concentration |
Zucker diabetic fatty (ZDF) rats – obese (FA/FA) or lean (FA/+) male | Charles River | https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-lean-fa?region=3611 https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-obese?region=3611 |
Obtained from Charles River (Wilmington, MA). Rats were acquired at 4 weeks of age and fed Purina 5008 until euthanasia (15-19 weeks of age). Glucose levels (blood from the lateral saphenous vein) were greater than 300 mg/dL in all FA/FA rats used in the study. All animals were housed in a temperature-controlled environment with a 12-h light-dark cycle and fed ad libitum. |