Driedimensionale kweek van gevasculariseerd thermogeen vetweefsel uit microvasculaire fragmenten

Summary

Hier presenteren we een gedetailleerd protocol dat het gebruik van microvasculaire fragmenten geïsoleerd uit knaagdier- of menselijk vetweefsel schetst als een eenvoudige benadering om functioneel, gevasculariseerd beige vetweefsel te engineeren.

Abstract

Engineering thermogeen vetweefsel (bijv. Beige of bruine vetweefsels) is onderzocht als een potentiële therapie voor metabole ziekten of voor het ontwerp van gepersonaliseerde microtissues voor gezondheidsscreening en medicijntests. De huidige strategieën zijn vaak vrij complex en slagen er niet in om de meercellige en functionele eigenschappen van thermogeen vetweefsel volledig weer te geven. Microvasculaire fragmenten, kleine intacte microvessels bestaande uit arteriol, venulen en haarvaten geïsoleerd uit vetweefsel, dienen als een enkele autologe bron van cellen die vascularisatie en vetweefselvorming mogelijk maken. Dit artikel beschrijft methoden voor het optimaliseren van kweekomstandigheden om het genereren van driedimensionale, gevasculariseerde en functionele thermogene vetweefsels uit microvasculaire fragmenten mogelijk te maken, inclusief protocollen voor het isoleren van microvasculaire fragmenten uit vetweefsel en kweekomstandigheden. Daarnaast worden best practices besproken, evenals technieken voor het karakteriseren van de gemanipuleerde weefsels, en monsterresultaten van zowel knaagdier als menselijke microvasculaire fragmenten worden verstrekt. Deze aanpak heeft het potentieel om te worden gebruikt voor het begrijpen en ontwikkelen van behandelingen voor obesitas en metabole ziekten.

Introduction

Het doel van dit protocol is om een aanpak te beschrijven voor het ontwikkelen van gevasculariseerd beige vetweefsel uit een enkele, potentieel autologe bron, microvasculair fragment (MVF). Van bruine en beige vetweefsels is aangetoond dat ze gunstige eigenschappen vertonen die verband houden met metabole regulatie; Het kleine volume van deze vetweefseldepots bij volwassenen beperkt echter de potentiële impact op het systemische metabolisme, met name bij zieke aandoeningen zoals obesitas of diabetes type 2 1,2,3,4,5,6,7. Er is aanzienlijke belangstelling voor bruin / beige vet als een therapeutisch doelwit voor het voorkomen van de schadelijke metabole effecten in verband met obesitas en de comorbiditeiten ervan 8,9,10,11,12.

MVF’s zijn vaatstructuren die direct kunnen worden geïsoleerd uit vetweefsel, gekweekt en gedurende langere tijd in een driedimensionale configuratie kunnen worden gehouden^13,14,15. Eerder werk van onze groep, en anderen, zijn begonnen met het exploiteren van de meercellige en multipotente capaciteit van MVF’s, met name als het gaat om de vorming van vetweefsel^16,17,18. Als een opbouw van dit werk hebben we onlangs aangetoond dat MVF’s afgeleid van knaagdiermodellen van gezonde en type 2 diabetes¹⁹ en van menselijke proefpersonen (volwassenen ouder dan 50 jaar)²⁰ cellen bevatten die kunnen worden geïnduceerd om thermogeen of beige vetweefsel te vormen.

Hierin is een innovatieve aanpak van waaruit een enkele bron MVF wordt gebruikt, niet alleen in staat om beige vetweefsel te creëren, maar ook de bijbehorende en kritische vasculaire component²¹. Het gebruik van deze techniek kan van grote waarde zijn voor studies die op zoek zijn naar een eenvoudige weefselmanipulatiebenadering voor de vorming van thermogene vetweefsels. In tegenstelling tot andere methoden die gericht zijn op het engineeren van beige vetweefsel 22,23,24,25,26,27,28^, vereist het proces dat in deze studie wordt beschreven niet het gebruik van meerdere celtypen of complexe inductieregimes. Gevasculariseerde beige en witte vetmodellen kunnen worden gemaakt met MVF’s afkomstig van knaagdieren en menselijke bronnen, wat een groot vertaalpotentieel aantoont. Het eindproduct van dit protocol is een beige thermogeen vetweefsel met een structuur en metabole functie vergelijkbaar met bruin vetweefsel. Over het algemeen presenteert dit protocol het idee dat een gemakkelijk toegankelijke en mogelijk autologe bron MVF een waardevolle therapeutische interventie en hulpmiddel kan zijn voor het bestuderen van metabole stoornissen.

Protocol

Dit onderzoek is uitgevoerd in overeenstemming met de Dierenwelzijnswet en de Uitvoeringsverordening Dierenwelzijn conform de uitgangspunten van de Handreiking Verzorging en Gebruik Proefdieren. Alle dierprocedures werden goedgekeurd door het Institutional Animal Care and Use Committee van de Universiteit van Texas in San Antonio. OPMERKING: Voor de hieronder beschreven stappen worden mannelijke Lewis Rats gebruikt. Kleine protocolaanpassingen moeten worden aangebracht voor een vrouwtje, evena…

Representative Results

Er zijn een paar belangrijke fenotypische morfologische kenmerken van beige / bruin vetweefsel: het is multiloculair / bevat kleine lipidedruppeltjes, bezit een groot aantal mitochondriën (de reden voor zijn karakteristieke “bruinachtige” uiterlijk in vivo), heeft dienovereenkomstig een hoog zuurstofverbruik / mitochondriale bio-energetica, is sterk gevasculariseerd, heeft een verhoogde lipolyse / insuline-gestimuleerde glucose-opname, en, het meest berucht, drukt hoge niveaus van ontkoppelingseiwit 1 (UCP1) u…

Discussion

Het gebied van bruin / beige vetweefseltechnologie is grotendeels onvolwassen 22,23,24,25,26,27,28, waarbij het grootste deel van de vetmodellen wordt ontwikkeld voor wit vetweefsel ^8,22,31. Gemanip…

Materials

Aminocaproic Acid	Sigma Aldrich	A2504-100G	Added in DMEM at the concentration of 1 mg/mL
Blunt-Tipped Scissors	Fisher scientific	12-000-172	Sterilize in autoclave
Bovin Serum Albumin (BSA)	Millipore	126575-10GM	Diluted in PBS to 4 mg/mL and 1 mg/mL
Collagenase Type 1	Fisher scientific	NC9633623	Diluted to 6 mg/mL in BSA 4 mg/mL, Digestion of minced fat
Dexamethasone	Thermo Scientific	AC230302500	Diluted in ethanol at a 2 mg/ml stock concentration
Disposable underpads	Fisher scientific	23-666-062	For fluid absorption during surgery
Dissecting Scissors	Fisher scientific	08-951-5	Sterilize in autoclave
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium (DMEM)	Fisher scientific	11885092
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM/F12)	Sigma Aldrich	D8062
Fetal Bovine Serum	Fisher scientific	16140089	Added in DMEM to 20% v/v.
Fibrinogen	Sigma Aldrich	F8630-25G	Solubilized in DMEM at the concentration of 20 mg/mL, Protein found in blood plasma and main component of hydrogel
Flask, 250 mL	Fisher scientific	FB500250	Allows for digestion of fat using a large surface area
Forceps	Fisher scientific	50-264-21	Sterilize in autoclave, For handling of tissue and filters
Forskolin	Sigma Aldrich	F6886	Diluted in ethanol at a 10 mM stock concentration
Human MVF	Advanced Solutions Life Scienes, LLC	https://www.advancedsolutions.com/microvessels	Human MVFs (hMVFs) isolated from three different patients (52-, 54-, and 56-year old females) were used in the current study.
Indomethacine	Sigma Aldrich	I7378	Diluted in ethanol at a 12.5 mM stock concentration
Insulin from porcine pancreas	Sigma Aldrich	I5523	Diluted in 0.01 N HCl at a 5 mg/ml stock concentration
MycoZap	Fisher scientific	NC9023832	Added in DMEM to 0.2% w/v, Mycoplasma Prophylactic
Pennycilin/Streptomycin (10,000 U/mL)	Fisher scientific	15140122	Added in DMEM to 1% v/v.
Petri dishes, polystyrene (100 mm x 15 mm).	Fisher scientific	351029	3 for removal of blood vessels and mincing, 8 (lid) for presoaking of screens & 8 (dish) for use when filtering with 500 or 37 µM screens
Petri dishes, polystyrene (35 mm x 10 mm).	Fisher scientific	50-202-036	For counting fragments
Phosphate Buffer Saline (PBS)	Fisher scientific	14-190-250	Diluted to 1x with sterile deionized water.
Rat Clippers (Andwin Mini Arco Pet Trimmer)	Fisher scientific	NC0854141
Rosiglitazone	Fisher scientific	R0106200MG	Diluted in DMSO at a 10 mM stock concentration
Scissors	Fine Science Tools	14059-11	1 for initial incision, 1 for epididymal incision, 1 for tip clipping
Screen  37 µM	Carolina Biological Supply Company	652222R	Cut into 3" rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Fragment entrapment and removal of very small fragments/single cells and debris
Screen 500 µM	Carolina Biological Supply Company	652222F	Cut into 3" rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Removes larger fragments/debris
Serrated Hemostat	Fisher scientific	12-000-171	Sterilize in autoclave, For clamping of skin before incision
Steriflip Filter 0.22 μm	Millipore	SE1M179M6
Thrombin	Fisher scientific	6051601KU	Diluted in deionzed water to 10 U/mL, Used as a clotting agent turning fibrinogen to fibrin
Thyroid hormone (T3)	Sigma Aldrich	T2877	Diluted in 1N NaOH at a 0.02 mM stock concentration
Zucker diabetic fatty (ZDF) rats – obese (FA/FA) or lean (FA/+) male	Charles River	https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-lean-fa?region=3611 https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-obese?region=3611	Obtained from Charles River (Wilmington, MA). Rats were acquired at 4 weeks of age and fed Purina 5008 until euthanasia (15-19 weeks of age). Glucose levels (blood from the lateral saphenous vein) were greater than 300 mg/dL in all FA/FA rats used in the study. All animals were housed in a temperature-controlled environment with a 12-h light-dark cycle and fed ad libitum.