微小血管断片からの血管新生熱発生脂肪組織の三次元培養
Summary
ここでは、機能的な血管新生ベージュ脂肪組織を設計するための簡単なアプローチとして、げっ歯類またはヒト脂肪組織から分離された微小血管断片の使用を概説する詳細なプロトコルを提示します。
Abstract
エンジニアリング熱発生脂肪組織(例えば、ベージュまたは褐色脂肪組織)は、代謝性疾患の潜在的な治療法として、または健康診断および薬物検査のための個別化された微小組織の設計のために研究されている。現在の戦略はしばしば非常に複雑であり、熱発生脂肪組織の多細胞および機能的特性を正確に完全に描写することができません。微小血管断片は、脂肪組織から単離された細動脈、細静脈、および毛細血管からなる小さな無傷の微小血管であり、血管新生および脂肪組織形成を可能にする単一の自家細胞源として機能する。この記事では、脂肪組織および培養条件から微小血管断片を分離するためのプロトコルを含む、微小血管断片から3次元、血管化、および機能的な熱発生脂肪組織を生成できるように培養条件を最適化する方法について説明します。さらに、ベストプラクティス、および操作された組織を特徴付けるための技術が議論され、げっ歯類とヒトの両方の微小血管断片からのサンプル結果が提供されます。このアプローチは、肥満や代謝性疾患の治療法の理解と開発に活用できる可能性があります。
Introduction
このプロトコルの目的は、単一の潜在的に自己由来の微小血管断片(MVF)から血管新生ベージュ脂肪組織を開発するためのアプローチを説明することです。茶色とベージュの脂肪組織は、代謝調節に関連する有益な特性を示すことが実証されています。ただし、成人のこれらの脂肪組織デポーの量が少ないため、特に肥満や2型糖尿病などの病状では、全身代謝への潜在的な影響が制限されます1,2,3,4,5,6,7。肥満とその併存疾患に関連する有害な代謝効果を予防するための治療標的として、茶色/ベージュ色の脂肪に大きな関心が寄せられています8,9,10,11,12。
MVFは、脂肪組織から直接単離し、培養し、長期間にわたって三次元構成で維持することができる血管構造である13、14、15。私たちのグループや他のグループからの以前の研究は、特に脂肪組織形成に関連するように、MVFの多細胞および多能性能力を利用し始めています16,17,18。この研究の積み重ねとして、私たちは最近、健康な2型糖尿病のげっ歯類モデル19およびヒト被験者(50歳以上の成人)20に由来するMVFに、熱発生またはベージュ色の脂肪組織を形成するように誘導できる細胞が含まれていることを実証しました。
本明細書は、単一ソースMVFが利用される革新的なアプローチであり、ベージュ脂肪組織だけでなく、その関連する重要な血管成分21も作成することができる。この技術の使用は、熱発生脂肪組織形成のための簡単な組織工学的アプローチを探している研究にとって非常に価値がある可能性があります。ベージュ色の脂肪組織を設計することを目指す他の方法22、23、24、25、26、27、28とは異なり、この研究に記載されているプロセスは、複数の細胞型または複雑な誘導レジメンを使用する必要はありません。血管化されたベージュおよび白色脂肪モデルは、げっ歯類およびヒト由来のMVFで作成でき、大きな翻訳の可能性を示しています。このプロトコルの最終製品は、褐色脂肪組織に匹敵する構造と代謝機能を備えた操作されたベージュの熱発生脂肪組織です。全体として、このプロトコルは、簡単にアクセスでき、おそらく自家ソースMVFが、代謝障害を研究するための価値のある治療的介入およびツールである可能性があるという考えを提示します。
Protocol
本研究は、動物愛護法および動物愛護規則施行規則に準拠して、実験動物の飼養及び利用に関する手引きの原則に従って実施された。すべての動物の手順は、テキサス大学サンアントニオ校の施設動物管理および使用委員会によって承認されました。 注:以下に説明する手順では、オスのルイスラットが使用されます。雌およびマウス微小血管断片(MVF)コレクションにつ?…
Representative Results
ベージュ/褐色脂肪組織のいくつかの重要な表現型の形態学的特徴があります:それは多房性であり、小さな脂肪滴を含み、多数のミトコンドリアを所有し(生体内でその特徴的に「茶色がかった」外観の理由)、それに応じて高い酸素消費率/ミトコンドリア生体エネルギーを有し、高度に血管新生され、脂肪分解/インスリン刺激グルコース取り込みを増加させ、そして最も悪名高い、 熱…
Discussion
ブラウン/ベージュの脂肪組織工学の分野は、ほとんど未成熟であり22,23,24,25,26,27,28であり、脂肪モデルの大部分は白色脂肪組織用に開発されています8,22,31<sup class="xr…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
アコスタ博士は、国立衛生研究所の助成金CA148724およびTL1TR002647によってサポートされています。ゴンザレス・ポラス博士は、国立衛生研究所の国立糖尿病・消化器・腎臓病研究所の支援を受けており、賞番号F32-0DK122754で報告されています。この研究は、国立衛生研究所(5SC1DK122578)とテキサス大学サンアントニオ校の生物医学工学科によって部分的にサポートされました。内容は著者の責任であり、必ずしも国立衛生研究所の公式見解を表すものではありません。図は部分的に Biorender.com で作成されました。
Materials
| Aminocaproic Acid | Sigma Aldrich | A2504-100G | Added in DMEM at the concentration of 1 mg/mL |
| Blunt-Tipped Scissors | Fisher scientific | 12-000-172 | Sterilize in autoclave |
| Bovin Serum Albumin (BSA) | Millipore | 126575-10GM | Diluted in PBS to 4 mg/mL and 1 mg/mL |
| Collagenase Type 1 | Fisher scientific | NC9633623 | Diluted to 6 mg/mL in BSA 4 mg/mL, Digestion of minced fat |
| Dexamethasone | Thermo Scientific | AC230302500 | Diluted in ethanol at a 2 mg/ml stock concentration |
| Disposable underpads | Fisher scientific | 23-666-062 | For fluid absorption during surgery |
| Dissecting Scissors | Fisher scientific | 08-951-5 | Sterilize in autoclave |
| Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium (DMEM) | Fisher scientific | 11885092 | |
| Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium/Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM/F12) | Sigma Aldrich | D8062 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher scientific | 16140089 | Added in DMEM to 20% v/v. |
| Fibrinogen | Sigma Aldrich | F8630-25G | Solubilized in DMEM at the concentration of 20 mg/mL, Protein found in blood plasma and main component of hydrogel |
| Flask, 250 mL | Fisher scientific | FB500250 | Allows for digestion of fat using a large surface area |
| Forceps | Fisher scientific | 50-264-21 | Sterilize in autoclave, For handling of tissue and filters |
| Forskolin | Sigma Aldrich | F6886 | Diluted in ethanol at a 10 mM stock concentration |
| Human MVF | Advanced Solutions Life Scienes, LLC | https://www.advancedsolutions.com/microvessels | Human MVFs (hMVFs) isolated from three different patients (52-, 54-, and 56-year old females) were used in the current study. |
| Indomethacine | Sigma Aldrich | I7378 | Diluted in ethanol at a 12.5 mM stock concentration |
| Insulin from porcine pancreas | Sigma Aldrich | I5523 | Diluted in 0.01 N HCl at a 5 mg/ml stock concentration |
| MycoZap | Fisher scientific | NC9023832 | Added in DMEM to 0.2% w/v, Mycoplasma Prophylactic |
| Pennycilin/Streptomycin (10,000 U/mL) | Fisher scientific | 15140122 | Added in DMEM to 1% v/v. |
| Petri dishes, polystyrene (100 mm x 15 mm). | Fisher scientific | 351029 | 3 for removal of blood vessels and mincing, 8 (lid) for presoaking of screens & 8 (dish) for use when filtering with 500 or 37 µM screens |
| Petri dishes, polystyrene (35 mm x 10 mm). | Fisher scientific | 50-202-036 | For counting fragments |
| Phosphate Buffer Saline (PBS) | Fisher scientific | 14-190-250 | Diluted to 1x with sterile deionized water. |
| Rat Clippers (Andwin Mini Arco Pet Trimmer) | Fisher scientific | NC0854141 | |
| Rosiglitazone | Fisher scientific | R0106200MG | Diluted in DMSO at a 10 mM stock concentration |
| Scissors | Fine Science Tools | 14059-11 | 1 for initial incision, 1 for epididymal incision, 1 for tip clipping |
| Screen 37 µM | Carolina Biological Supply Company | 652222R | Cut into 3" rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Fragment entrapment and removal of very small fragments/single cells and debris |
| Screen 500 µM | Carolina Biological Supply Company | 652222F | Cut into 3" rounded squares and sterilized in ethylene oxide, Removes larger fragments/debris |
| Serrated Hemostat | Fisher scientific | 12-000-171 | Sterilize in autoclave, For clamping of skin before incision |
| Steriflip Filter 0.22 μm | Millipore | SE1M179M6 | |
| Thrombin | Fisher scientific | 6051601KU | Diluted in deionzed water to 10 U/mL, Used as a clotting agent turning fibrinogen to fibrin |
| Thyroid hormone (T3) | Sigma Aldrich | T2877 | Diluted in 1N NaOH at a 0.02 mM stock concentration |
| Zucker diabetic fatty (ZDF) rats – obese (FA/FA) or lean (FA/+) male | Charles River | https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-lean-fa?region=3611 https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-obese?region=3611 |
Obtained from Charles River (Wilmington, MA). Rats were acquired at 4 weeks of age and fed Purina 5008 until euthanasia (15-19 weeks of age). Glucose levels (blood from the lateral saphenous vein) were greater than 300 mg/dL in all FA/FA rats used in the study. All animals were housed in a temperature-controlled environment with a 12-h light-dark cycle and fed ad libitum. |
Referências
- Cohen, P., Spiegelman, B. M. Brown and beige fat: molecular parts of a thermogenic machine. Diabetes. 64 (7), 2346-2351 (2015).
- Liu, X., et al. Brown adipose tissue transplantation reverses obesity in Ob/Ob mice. Endocrinology. 156 (7), 2461-2469 (2015).
- Tharp, K. M., Stahl, A. Bioengineering beige adipose tissue therapeutics. Frontiers in Endocrinology. 6, 164 (2015).
- Barquissau, V., et al. White-to-brite conversion in human adipocytes promotes metabolic reprogramming towards fatty acid anabolic and catabolic pathways. Molecular Metabolism. 5 (5), 352-365 (2016).
- Kim, S. H., Plutzky, J. Brown fat and browning for the treatment of obesity and related metabolic disorders. Diabetes & Metabolism Journal. 40 (1), 12-21 (2016).
- Lizcano, F., Vargas, D. Biology of beige adipocyte and possible therapy for type 2 diabetes and obesity. International Journal of Endocrinology. 2016, 9542061 (2016).
- Mulya, A., Kirwan, J. P. Brown and beige adipose tissue: therapy for obesity and its comorbidities. Endocrinology and Metabolism Clinics of North America. 45 (3), 605-621 (2016).
- Murphy, C. S., Liaw, L., Reagan, M. R. In vitro tissue-engineered adipose constructs for modeling disease. BMC Biomedical Engineering. 1, 27 (2019).
- Srivastava, S., Veech, R. L. Brown and brite: The fat soldiers in the anti-obesity fight. Frontiers in Physiology. 10, 38 (2019).
- Samuelson, I., Vidal-Puig, A. Studying brown adipose tissue in a human in vitro context. Frontiers in Endocrinology. 11, 629 (2020).
- Wang, C. -. H., et al. CRISPR-engineered human brown-like adipocytes prevent diet-induced obesity and ameliorate metabolic syndrome in mice. Science Translational Medicine. 12 (558), (2020).
- Kaisanlahti, A., Glumoff, T. Browning of white fat: agents and implications for beige adipose tissue to type 2 diabetes. Journal of Physiology and Biochemistry. 75 (1), 1-10 (2019).
- Sato, N., et al. Development of capillary networks from rat microvascular fragments in vitro: the role of myofibroblastic cells. Microvascular Research. 33 (2), 194-210 (1987).
- Laschke, M. W., Später, T., Menger, M. D. Microvascular fragments: More than just natural vascularization units. Trends in Biotechnology. 39 (1), 24-33 (2021).
- Hoying, J. B., Boswell, C. A., Williams, S. K. Angiogenic potential of microvessel fragments established in three-dimensional collagen gels. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Animal. 32 (7), 409-419 (1996).
- Acosta, F. M., Stojkova, K., Brey, E. M., Rathbone, C. R. A straightforward approach to engineer vascularized adipose tissue using microvascular fragments. Tissue Engineering. Part A. 26 (15-16), 905-914 (2020).
- Acosta, F. M., et al. Adipogenic differentiation alters properties of vascularized tissue-engineered skeletal muscle. Tissue Engineering. Part A. 28 (1-2), 54-68 (2021).
- Strobel, H. A., Gerton, T., Hoying, J. B. Vascularized adipocyte organoid model using isolated human microvessel fragments. Biofabrication. 13 (3), 035022 (2021).
- Acosta, F. M., et al. Engineering functional vascularized beige adipose tissue from microvascular fragments of models of healthy and type II diabetes conditions. Journal of Tissue Engineering. 13, 20417314221109337 (2022).
- Gonzalez Porras, M. A., Stojkova, K., Acosta, F. M., Rathbone, C. R., Brey, E. M. Engineering human beige adipose tissue. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 10, 906395 (2022).
- Herold, J., Kalucka, J. Angiogenesis in adipose tissue: The interplay between adipose and endothelial cells. Frontiers in Physiology. 11, 1861 (2021).
- McCarthy, M., et al. Fat-On-A-Chip models for research and discovery in obesity and its metabolic comorbidities. Tissue Engineering Part B: Reviews. 26 (6), 586-595 (2020).
- Klingelhutz, A. J., et al. Scaffold-free generation of uniform adipose spheroids for metabolism research and drug discovery. Scientific Reports. 8 (1), 523 (2018).
- Yang, J. P., et al. Metabolically active three-dimensional brown adipose tissue engineered from white adipose-derived stem cells. Tissue Engineering. Part A. 23 (7-8), 253-262 (2017).
- Vaicik, M. K., et al. Hydrogel-based engineering of beige adipose tissue. Journal of Materials Chemistry B. 3 (40), 7903-7911 (2015).
- Tharp, K. M., Stahl, A. Bioengineering beige adipose tissue therapeutics. Frontiers in Endocrinology. 6, 164 (2015).
- Tharp, K. M., et al. Matrix-assisted transplantation of functional beige adipose tissue. Diabetes. 64 (11), 3713-3724 (2015).
- Harms, M. J., et al. Mature human white adipocytes cultured under membranes maintain identity, function, and can transdifferentiate into brown-like adipocytes. Cell Reports. 27 (1), 213-225 (2019).
- Frueh, F. S., Später, T., Scheuer, C., Menger, M. D., Laschke, M. W. Isolation of murine adipose tissue-derived microvascular fragments as vascularization units for tissue engineering. Journal of Visualized Experiments. (122), e55721 (2017).
- Cannon, B., Nedergaard, J. Brown adipose tissue: Function and physiological significance. Physiological Reviews. 84 (1), 277-359 (2004).
- Unser, A. M., Tian, Y., Xie, Y. Opportunities and challenges in three-dimensional brown adipogenesis of stem cells. Biotechnology Advances. 33, 962-979 (2015).
- Dani, V., Yao, X., Dani, C. Transplantation of fat tissues and iPSC-derived energy expenditure adipocytes to counteract obesity-driven metabolic disorders: Current strategies and future perspectives. Reviews in Endocrine & Metabolic Disorders. 23 (1), 103-110 (2022).
- Xu, X., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments as vascularization units for dental pulp regeneration. Journal of Endodontics. 47 (7), 1092-1100 (2021).
- McDaniel, J. S., Pilia, M., Ward, C. L., Pollot, B. E., Rathbone, C. R. Characterization and multilineage potential of cells derived from isolated microvascular fragments. Journal of Surgical Research. 192 (1), 214-222 (2014).
- Gealekman, O., et al. Depot-specific differences and insufficient subcutaneous adipose tissue angiogenesis in human obesity. Circulation. 123 (2), 186-194 (2011).
- Altalhi, W., Hatkar, R., Hoying, J. B., Aghazadeh, Y., Nunes, S. S. Type I diabetes delays perfusion and engraftment of 3D constructs by impinging on angiogenesis; which can be rescued by hepatocyte growth factor supplementation. Cellular and Molecular Bioengineering. 12 (5), 443-454 (2019).
- Altalhi, W., Sun, X., Sivak, J. M., Husain, M., Nunes, S. S. Diabetes impairs arterio-venous specification in engineered vascular tissues in a perivascular cell recruitment-dependent manner. Biomaterials. 119, 23-32 (2017).
- Laschke, M. W., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments from aged donors exhibit an impaired vascularisation capacity. European Cells & Materials. 28, 287-298 (2014).
- Später, T., et al. Vascularization of microvascular fragment isolates from visceral and subcutaneous adipose tissue of mice. Tissue Engineering and Regenerative Medicine. 19 (1), 161-175 (2021).
- Später, T., et al. Adipose tissue-derived microvascular fragments from male and female fat donors exhibit a comparable vascularization capacity. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 9, 777687 (2021).
- Laschke, M. W., Menger, M. D. The simpler, the better: tissue vascularization using the body’s own resources. Trends in Biotechnology. 40 (3), 281-290 (2022).
- Yang, F., Cohen, R. N., Brey, E. M. Optimization of co-culture conditions for a human vascularized adipose tissue model. Bioengenharia. 7 (3), 114 (2020).
- Pilkington, A. -. C., Paz, H. A., Wankhade, U. D. Beige adipose tissue identification and marker specificity-Overview. Frontiers in Endocrinology. 12, 599134 (2021).
- Chiou, G., et al. Scaffold architecture and matrix strain modulate mesenchymal cell and microvascular growth and development in a time dependent manner. Cellular and Molecular Bioengineering. 13 (5), 507-526 (2020).
Citar este artigo
Acosta, F. M., Gonzalez Porras, M. A., Stojkova, K., Pacelli, S., Rathbone, C. R., Brey, E. M. Three-Dimensional Culture of Vascularized Thermogenic Adipose Tissue from Microvascular Fragments. J. Vis. Exp. (192), e64650, doi:10.3791/64650 (2023).