Imagem de lapso de tempo 3D da dinâmica da parede celular usando Calcofluor no musgo Physcomitrium patens
Summary
Este manuscrito apresenta um protocolo detalhado para a imagem da dinâmica da parede celular 3D do tecido de musgo vivo, permitindo a visualização do descolamento das paredes celulares em mutantes ggb e do espessamento dos padrões da parede celular no tipo selvagem durante o desenvolvimento durante um longo período.
Abstract
A imagem de lapso de tempo com microscopia de fluorescência permite a observação das mudanças dinâmicas de crescimento e desenvolvimento nos níveis celular e subcelular. Em geral, para observações durante um longo período, a técnica requer a transformação de uma proteína fluorescente; no entanto, para a maioria dos sistemas, a transformação genética é demorada ou tecnicamente indisponível. Este manuscrito apresenta um protocolo para imagem de time-lapse 3-D da dinâmica da parede celular durante um período de 3 dias usando corante calcofluor (que cora celulose na parede celular da planta), desenvolvido no musgo Physcomitrium patens. O sinal de corante calcofluor da parede celular é estável e pode durar 1 semana sem decaimento óbvio. Usando este método, foi demonstrado que o descolamento de células em mutantes ggb (nos quais a subunidade beta da proteína geranilgeraniltransferase-I é nocauteada) é causado por expansão celular desregulada e defeitos de integridade da parede celular. Além disso, os padrões de coloração de calcofluor mudam ao longo do tempo; regiões coradas menos intensamente correlacionam-se com os futuros locais de expansão/ramificação celular no tipo selvagem. Este método pode ser aplicado a muitos outros sistemas que contêm paredes celulares e que podem ser corados por calcofluor.
Introduction
As paredes celulares das plantas sofrem alterações dinâmicas durante a expansão e o desenvolvimento celular 1,2,3. Manter a integridade da parede celular é fundamental para a adesão das células vegetais durante o crescimento e desenvolvimento, bem como para a resposta aos sinais ambientais. Embora a visualização da dinâmica da parede celular de células vivas durante um longo período de tempo seja fundamental para entender como a adesão celular é mantida durante o desenvolvimento e a adaptação às mudanças ambientais, os métodos atuais para observar diretamente a dinâmica da parede celular ainda são desafiadores.
A imagem de lapso de tempo de alterações celulares pode fornecer dinâmica de desenvolvimento informativa de um organismo usando um microscópio de fluorescência de alta resolução 4,5,6,7. Embora a imagem 3D de lapso de tempo tenha um grande potencial para estudar mudanças dinâmicas da forma celular durante o crescimento e desenvolvimento, a técnica normalmente requer a transformação de uma proteína fluorescente 4,5,6,7. No entanto, para a maioria dos sistemas, as transformações genéticas são demoradas ou tecnicamente desafiadoras. Como alternativa, os corantes fluorescentes que se ligam aos componentes celulares estão disponíveis há muito tempo. Os corantes fluorescentes podem emitir luz fluorescente após irradiação com luz de um certo comprimento de onda. Exemplos comuns são Edu, DAPI, PI, FM4-64 e calcofluor branco 8,9,10. Uma grande desvantagem, no entanto, é que esses corantes normalmente só podem ser usados em tecido fixo ou para experimentos curtos, em parte devido ao dano que causam à célula 8,9,10.
Com o protocolo aqui apresentado, os sinais de calcofluor são estáveis quando o calcofluor branco é misturado dentro do meio durante experimentos de lapso de tempo no musgo P. patens. Usando esse método, o descolamento de células em mutantes ggb usando imagens de lapso de tempo 3-D foi observado durante um período de 3 dias3 (Figura 1). Este método pode ser aplicado a muitos outros sistemas que contêm paredes celulares e que podem ser corados por calcofluor.
Protocol
Representative Results
Discussion
A reconstrução 3D de lapso de tempo, ou imagem 4D, é uma ferramenta poderosa para observar a dinâmica da morfologia celular durante os processos de desenvolvimento. Neste protocolo, misturando o branco calcofluor no meio, a dinâmica da morfologia celular 3D pode ser observada no musgo P. patens. Utilizando esse método, observamos que a superfície das paredes celulares em mutantes ggb é rasgada durante o desenvolvimento3. Além disso, o espessamento reduzido das paredes ce…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem à Dra. Soucy Patricia e Betty Nunn, da Universidade de Louisville, pela assistência com o microscópio confocal. Este trabalho foi financiado pela National Science Foundation (1456884 a M.P.R.) e por um Acordo de Cooperação da National Science Foundation (1849213 a M.P.R.).
Materials
| 3-mm-thick red plastic light filter | Mitsubishi | no.102 | |
| 27 mm diameter glass base dish | Iwaki | 3930-035 | |
| Agar | Sigma | A6924 | |
| Calcofluor white | Sigma | 18909-100ML-F | Calcofluor White M2R, 1 g/L and Evans blue, 0.5 g/L |
| Confocal microscope | Nikon | A1 |
NIS element software; .nd2 file in NIS-elements Viewer, download from https://www.microscope.healthcare.nikon. |
| Fluorescence microscope | Nikon | TE200 | Equipped with a DS-U3 camera; |
| Gellan gum | Nacali Tesque | 12389-96 | |
| Plant Growth Chambers | SANYO | Sanyo MLR-350H | |
| Sterilized syringe 0.22 μm filter | Millipore | SLGV033RS |
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