Çok Yönlü Dolaşımdaki Tümör Hücrelerinin İzolasyonu için Klinik Mikroakışkan Çip Platformu
Summary
Klinik mikroakışkan çip, klinik hasta kan numunesinin ön işlenmesini basitleştiren ve çip üzerinde yerinde dolaşan tümör hücrelerini (CTC’ler) yerinde boyayarak tek bir CTC’nin hızlı bir şekilde tespit edilmesini ve tanımlanmasını sağlayan önemli bir biyomedikal analiz tekniğidir.
Abstract
Dolaşımdaki tümör hücreleri (CTC’ler) kanser prognozu, tanısı ve anti-kanser tedavisinde önemlidir. CTC’ler nadir ve heterojen olduğu için CTC sayımı hasta hastalığını belirlemede hayati önem taşır. CTC’ler primer tümörden ayrılır, kan dolaşım sistemine girer ve potansiyel olarak uzak bölgelerde büyür, böylece tümörü metastaz yapar. CTC’ler primer tümöre benzer bilgiler taşıdığından, CTC izolasyonu ve müteakip karakterizasyonu kanserin izlenmesi ve teşhisinde kritik olabilir. Nadir CTC’lerin sayımı, afinite modifikasyonu ve klinik immünofloresan boyaması, gerekli elementleri yüksek hassasiyetle sağladıkları için CTC izolasyonu için güçlü yöntemlerdir. Mikroakışkan çipler, hastalar için ağrısız bir likit biyopsi yöntemi sunar. Bu çalışmada, CTC ayırma, analiz ve erken tanı için gerekli olan bir dizi işlevsellik ve hizmeti içeren, böylece biyomoleküler analiz ve kanser tedavisini kolaylaştıran çok yönlü bir CTC izolasyon platformu olan klinik mikroakışkan çipler için bir protokol listesi sunuyoruz. Program, nadir tümör hücresi sayımı, kırmızı kan hücresi lizizini içeren klinik hasta kan ön işlemesini ve mikroakışkan çipler üzerinde yerinde CTC’lerin izolasyonunu ve tanınmasını içerir. Program, tümör hücrelerinin veya CTC’lerin kesin sayımına izin verir. Ek olarak, program, çok yönlü mikroakışkan çipler ile CTC izolasyonunu ve çipler üzerinde yerinde immünofloresan tanımlamasını ve ardından biyomoleküler analizi içeren bir araç içerir.
Introduction
Dolaşımdaki tümör hücreleri (CTC’ler) kanser prognozu, tanısı ve anti-kanser tedavisinde önemlidir. CTC’ler nadir ve heterojen olduğu için CTC numaralandırması hayati önem taşır. Nadir CTC’lerin sayımı, afinite modifikasyonu ve klinik immünofloresan boyaması, CTC izolasyonu için güçlü tekniklerdir, çünkü gerekli unsurları yüksek duyarlılıkla sunarlar1. Normal kanla karışan nadir sayıda tümör hücresi, gerçek hasta kanını yakından taklit eder, çünkü 2-3 mL gerçek hasta kanı sadece 1-10 CTC içerir. Kritik bir deneysel problemi çözmek için, PBS’ye sokulan veya normal kanla karıştırılan çok sayıda tümör hücresi kullanmak yerine, nadir sayıda tümör hücresinin kullanılması, bir deney yaparken gerçeğe daha yakın olan düşük sayıda kan hücresi sağlar.
Kanser dünyada önde gelen ölüm nedenidir2. CTC’ler, kan ve lenfatik dolaşım sistemlerinde dolaşan orijinal tümörden dökülen tümör hücreleridir3. CTC’ler yeni bir hayatta kalma ortamına taşındıklarında, ikinci bir tümör olarak büyürler. Buna metastaz denir ve kanser hastalarında ölümlerin %90’ından sorumludur4. CTC’ler prognoz, erken tanı ve kanser mekanizmalarının anlaşılması için hayati öneme sahiptir. Bununla birlikte, CTC’ler hasta kanında son derece nadir ve heterojendir 5,6.
Mikroakışkan çipler, tümörü istila etmeyen sıvı bir biyopsi sunar. Taşınabilir, düşük maliyetli ve hücre uyumlu bir ölçeğe sahip olma avantajına sahiptirler. CTC’lerin mikroakışkan çiplerle izolasyonu esas olarak iki tipte sınıflandırılır: antijen-antikor bağlanmasınadayanan 7,8,9 afinite tabanlı ve orijinal ve en yaygın kullanılan CTC izolasyon yöntemidir; ve tümör hücreleri ile kan hücreleri10,11,12,13,14,15 arasındaki boyut ve deforme olabilirlik farklılıklarını kullanan fiziksel tabanlı çipler etiketsizdir ve kullanımı kolaydır. Mikroakışkan çiplerin alternatif tekniklere göre avantajı, büyük elips mikrofiltrelerin fiziksel tabanlı yaklaşımının, CTC’leri yüksek yakalama verimliliği ile sıkıca yakalamasıdır. Bunun nedeni, elips mikro direklerin ince hat hattı boşlukları tünelleri halinde düzenlenmesidir. Çizgi-çizgi boşlukları, eşkenar dörtgen mikro direkler gibi mikro direkler tarafından oluşturulan geleneksel nokta-nokta boşluklarından farklıdır. CTC’lerin dalga çipi tabanlı yakalanması, hem fiziksel özellik tabanlı hem de afinite tabanlı izolasyonu birleştirir. Dalga çipi tabanlı yakalama, dairesel mikropostlar üzerinde kaplanmış anti-EpCAM antikoru ile 30 dalga şeklinde diziyi içerir. CTC’ler küçük boşluklar tarafından yakalanır ve büyük boşluklar akış hızını hızlandırmak için kullanılır. Kaçırılan CTC’lerin bir sonraki dizideki küçük boşlukları geçmesi gerekir ve çip16’nın içine entegre edilmiş afinite tabanlı izolasyon tarafından yakalanır.
Protokolün amacı, nadir sayıda tümör hücresinin sayımını ve mikroakışkan çiplerle CTC’lerin klinik analizini göstermektir. Protokol, CTC izolasyon adımlarını, az sayıda tümör hücresinin nasıl elde edileceğini, küçük elips filtrelerin, büyük elips filtrelerin ve yamuk filtrelerin klinik fiziksel ayrımını, afinite modifikasyonunu ve zenginleştirmeyi açıklar17.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kanserin prognozu ve erken tanısı kanser tedavisi üzerinde önemli bir etkiye sahiptir1. Mikroakışkan çiplerle CTC izolasyonu, invazyon olmadan sıvı biyopsi imkanı sunar. Bununla birlikte, CTC’ler kanda son derece nadir ve heterojendir1, bu da CTC’leri izole etmeyi zorlaştırır. CTC’ler, kaynaklandıkları orijinal tümör kaynaklarına benzer özelliklere sahiptir. Bu nedenle, CTC’ler kanser metastazında hayati bir rol oynar1.
<p cl…Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma çalışması, Çin Anhui Doğa Bilimleri Vakfı (1908085MF197, 1908085QB66), Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (21904003), Tianjin Eğitim Komisyonu Bilimsel Araştırma Projesi (2018KJ154), Anhui Eyaleti Yüksek Öğretim Kurumları İl Doğa Bilimleri Araştırma Programı (KJ2020A0239) ve Şanghay Çok Boyutlu Bilgi İşleme Anahtar Laboratuvarı, Doğu Çin Çok Boyutlu Bilgi Anahtar Laboratuvarı tarafından desteklenmiştir İşleme, Doğu Çin Normal Üniversitesi (MIP20221).
Materials
| Calcein AM | BIOTIUM | 80011 | |
| calibrated microcapillary pipettes | Sigma- Aldrich | P0799 | |
| CD45-PE | BD Biosciences | 560975 | |
| CK-FITC | BD Biosciences | 347653 | cytokeratin monoclonal antibody |
| DMEM | HyClone | SH30081.05 | |
| fetal bovine serum (FBS) | GIBCO,USA | 26140 | |
| Hoechst 33342 | Molecular Probes, Solarbio Corp., China | C0031 | |
| penicillin-streptomycin | Ying Reliable biotechnology, China | ||
| Red blood cells lysis (RBCL) | Solarbio, Beijing | R1010 |
Referências
- Chen, H., et al. Highly-sensitive capture of circulating tumor cells using micro-ellipse filters. Scientific Reports. 7 (1), 610 (2017).
- . World Health Organization Cancer report Available from: https://www.who.int/news-room/fact-sheets/detail/cancer (2022)
- Pantel, K., Brakenhoff, R. H., Brandt, B. Detection, clinical relevance and specific biological properties of disseminating tumour cells. Nature Reviews Cancer. 8 (5), 329-340 (2008).
- Mehlen, P., Puisieux, A. Metastasis: A question of life or death. Nature Reviews Cancer. 6 (6), 449-458 (2006).
- Sollier, E., et al. Size-selective collection of circulating tumor cells using Vortex technology. Lab on a Chip. 14 (1), 63-77 (2014).
- Stott, S. L., et al. Isolation and characterization of circulating tumor cells from patients with localized and metastatic prostate cancer. Science Translational Medicine. 2 (25), 23 (2010).
- Stott, S. L., et al. Isolation of circulating tumor cells using a microvortex-generating herringbone-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (43), 18392-18397 (2010).
- Nagrath, S., et al. Isolation of rare circulating tumor cells in cancer patients by microchip technology. Nature. 450 (7173), 1235-1239 (2007).
- Murlidhar, V., et al. A radial flow microfluidic device for ultra-high-throughput affinity-based isolation of circulating tumor cells. Small. 10 (23), 4895-4904 (2014).
- Tan, S. J., Yobas, L., Lee, G. Y. H., Ong, C. N., Lim, C. T. Microdevice for the isolation and enumeration of cancer cells from blood. Biomedical Microdevices. 11 (4), 883-892 (2009).
- Preira, P., et al. Passive circulating cell sorting by deformability using a microfluidic gradual filter. Lab on a Chip. 13 (1), 161-170 (2013).
- Yan, S., Zhang, J., Yuan, D., Li, W. Hybrid microfluidics combined with active and passive approaches for continuous cell separation. Electrophoresis. 38 (2), 238-249 (2017).
- Patil, P., Madhuprasad Kumeria, T., Losic, D., Kurkuri, M. Isolation of circulating tumour cells by physical means in a microfluidic device: A review. RSC Advances. 5 (109), 89745-89762 (2015).
- Kumeria, T., et al. Photoswitchable membranes based on peptide-modified nanoporous anodic alumina: Toward smart membranes for on-demand molecular transport. Advanced Materials. 27 (19), 3019-3024 (2015).
- Mahesh, P. B., et al. Recent advances in microfluidic platform for physical and immunological detection and capture of circulating tumor cells. Biosensors. 12 (4), 220 (2022).
- Chen, H., Cao, B., Chen, H., Lin, Y. -. S., Zhang, J. Combination of antibody-coated, physical-based microfluidic chip with wave-shaped arrays for isolating circulating tumor cells. Biomedical Microdevices. 19 (3), 66 (2017).
- Rushton, A. J., Nteliopoulos, G., Shaw, J. A., Coombes, R. C. A review of circulating tumour cell enrichment technologies. Cancers. 13 (5), 970 (2021).
- Chen, H., Zhang, Z. An inertia-deformability hybrid CTC chip: Design, clinical test and numerical study. Journal of Medical Devices. 12 (4), 041004 (2018).
