Det kliniska mikrofluidiska chipet är en viktig biomedicinsk analysteknik som förenklar förbehandling av blodprov från kliniska patienter och immunofluorescerande fläckar cirkulerande tumörceller (CTC) in situ på chipet, vilket möjliggör snabb upptäckt och identifiering av en enda CTC.
Cirkulerande tumörceller (CTC) är signifikanta i cancerprognos, diagnos och anti-cancerbehandling. CTC-uppräkning är avgörande för att bestämma patientens sjukdom eftersom CTC är sällsynta och heterogena. CTC lossnar från den primära tumören, går in i blodcirkulationssystemet och växer potentiellt på avlägsna platser, vilket metastaserar tumören. Eftersom CTC bär liknande information som den primära tumören kan CTC-isolering och efterföljande karakterisering vara avgörande för övervakning och diagnos av cancer. Räkning, affinitetsmodifiering och klinisk immunofluorescensfärgning av sällsynta CTC är kraftfulla metoder för CTC-isolering eftersom de ger de nödvändiga elementen med hög känslighet. Mikrofluidiska chips erbjuder en flytande biopsimetod som är fri från smärta för patienterna. I detta arbete presenterar vi en lista över protokoll för kliniska mikrofluidikchips, en mångsidig CTC-isoleringsplattform, som innehåller en uppsättning funktioner och tjänster som krävs för CTC-separation, analys och tidig diagnos, vilket underlättar biomolekylär analys och cancerbehandling. Programmet inkluderar sällsynt tumörcellräkning, klinisk förbehandling av patientblod, vilket inkluderar rödblodslys och isolering och igenkänning av CTC in situ på mikrofluidiska chips. Programmet möjliggör exakt uppräkning av tumörceller eller CTC. Dessutom innehåller programmet ett verktyg som innehåller CTC-isolering med mångsidiga mikrofluidiska chips och immunofluorescensidentifiering in situ på chipsen, följt av biomolekylär analys.
Cirkulerande tumörceller (CTC) är signifikanta i cancerprognos, diagnos och anti-cancerbehandling. CTC-uppräkning är avgörande eftersom CTC är sällsynta och heterogena. Räkning, affinitetsmodifiering och klinisk immunofluorescensfärgning av sällsynta CTC är kraftfulla tekniker för CTC-isolering eftersom de erbjuder de nödvändiga elementen med hög känslighet1. Sällsynt antal tumörceller blandade med normalt blod efterliknar nära riktigt patientblod eftersom 2-3 ml verkligt patientblod endast innehåller 1-10 CTC. För att lösa ett kritiskt experimentellt problem, istället för att använda ett stort antal tumörceller införda i PBS eller blandat med normalt blod, ger användningen av sällsynt antal tumörceller oss ett lågt antal blodkroppar, vilket är närmare verkligheten när man utför ett experiment.
Cancer är den främsta dödsorsaken i världen2. CTC är tumörceller som kastas från den ursprungliga tumören som cirkulerar i blodet och lymfcirkulationssystemen3. När CTC flyttar till en ny överlevnadsmiljö växer de som en andra tumör. Detta kallas metastaser och är ansvarig för 90% av dödsfallen hos cancerpatienter4. CTC är avgörande för prognos, tidig diagnos och för att förstå mekanismerna för cancer. CTC är dock extremt sällsynta och heterogena i patientblod 5,6.
Mikrofluidiska chips erbjuder en flytande biopsi som inte invaderar tumören. De har fördelen av att vara bärbara, låga kostnader och ha en cellmatchad skala. Isoleringen av CTC med mikrofluidiska chips klassificeras huvudsakligen i två typer: affinitetsbaserad, som bygger på antigen-antikroppsbindning 7,8,9 och är den ursprungliga och mest använda metoden för CTC-isolering; och fysikaliskt baserade chips, som utnyttjar storleks- och deformerbarhetsskillnader mellan tumörceller och blodceller 10,11,12,13,14,15, är etikettfria och är lätta att använda. Fördelen med mikrofluidiska chips jämfört med alternativa tekniker är att det fysikaliska tillvägagångssättet för stora ellipsmikrofilter fångar CTC med hög infångningseffektivitet. Anledningen till detta är att ellipsmikrostolpar är organiserade i smala tunnlar av linjelinjegap. Linjelinjegapen skiljer sig från de traditionella punktpunktsgapen som bildas av mikrostolpar som rombmikrostolpar. Vågchipbaserad infångning av CTC kombinerar både fysisk egenskapsbaserad och affinitetsbaserad isolering. Vågchipbaserad fångst involverar 30 vågformade matriser med antikroppen av anti-EpCAM belagd på cirkulära mikrostolpar. CTC: erna fångas upp av de små luckorna, och de stora luckorna används för att påskynda flödeshastigheten. De missade CTC: erna måste passera de små luckorna i nästa matris och fångas av den affinitetsbaserade isoleringen integrerad inuti chip16.
Målet med protokollet är att demonstrera räkning av sällsynt antal tumörceller och klinisk analys av CTC med mikrofluidiska chips. Protokollet beskriver CTC-isoleringsstegen, hur man erhåller ett lågt antal tumörceller, den kliniska fysiska separationen av små ellipsfilter, stora ellipsfilter och trapetsfilter, affinitetsmodifiering och anrikning17.
Prognosen och tidig diagnos av cancer har en signifikant effekt på cancerbehandling1. CTC-isolering med mikrofluidiska chips erbjuder en flytande biopsi utan invasion. CTC är dock extremt sällsynta och heterogena i blodet1, vilket gör det utmanande att isolera CTC. CTC har liknande egenskaper som de ursprungliga tumörkällorna från vilka de härstammar. Således spelar CTC en viktig roll vid cancermetastaser1.
Det f…
The authors have nothing to disclose.
Detta forskningsarbete stöddes av Anhui Natural Science Foundation of China (1908085MF197, 1908085QB66), National Natural Science Foundation of China (21904003), Tianjins utbildningskommissions vetenskapliga forskningsprojekt (2018KJ154), Provincial Natural Science Research Program of Higher Education Institutions of Anhui Province (KJ2020A0239) och Shanghai Key Laboratory of Multidimensional Information Processing, East China Key Laboratory of Multidimensional Information Bearbetning, East China Normal University (MIP20221).
Calcein AM | BIOTIUM | 80011 | |
calibrated microcapillary pipettes | Sigma- Aldrich | P0799 | |
CD45-PE | BD Biosciences | 560975 | |
CK-FITC | BD Biosciences | 347653 | cytokeratin monoclonal antibody |
DMEM | HyClone | SH30081.05 | |
fetal bovine serum (FBS) | GIBCO,USA | 26140 | |
Hoechst 33342 | Molecular Probes, Solarbio Corp., China | C0031 | |
penicillin-streptomycin | Ying Reliable biotechnology, China | ||
Red blood cells lysis (RBCL) | Solarbio, Beijing | R1010 |