Modellierung des oral-ösophagealen Plattenepithelkarzinoms in 3D-Organoiden
Summary
Dieses Protokoll beschreibt die wichtigsten Schritte zur Erzeugung und Charakterisierung von murinen oral-ösophagealen 3D-Organoiden, die normale, präneoplastische und Plattenepithelkarzinomläsionen darstellen, die durch chemische Karzinogenese induziert werden.
Abstract
Das Plattenepithelkarzinom der Speiseröhre (ESCC) ist weltweit weit verbreitet und macht jedes Jahr 90 % aller Fälle von Speiseröhrenkrebs aus und ist das tödlichste aller menschlichen Plattenepithelkarzinome. Trotz jüngster Fortschritte bei der Definition der molekularen Veränderungen, die mit der Initiierung und Entwicklung von ESCC einhergehen, bleibt die Prognose der Patienten schlecht. Die funktionelle Annotation dieser molekularen Veränderungen ist der notwendige nächste Schritt und erfordert Modelle, die sowohl die molekularen Eigenschaften von ESCC erfassen als auch leicht und kostengünstig für die funktionelle Annotation manipuliert werden können. Mäuse, die mit dem Tabakrauchmimetikum 4-Nitrochinolin-1-oxid (4NQO) behandelt wurden, bilden vorhersagbar ESCC und ösophageale Präneoplasien. Bemerkenswert ist, dass 4NQO-Läsionen auch in der Mundhöhle auftreten, am häufigsten in der Zunge, sowie im Vormagen, die alle das geschichtete Plattenepithel teilen. Diese Mäuse können jedoch nicht einfach für funktionale Hypothesentests manipuliert werden, da die Erstellung isogener Mausmodelle zeit- und ressourcenintensiv ist. In dieser Arbeit überwinden wir diese Einschränkung, indem wir aus Einzelzellen abgeleitete dreidimensionale (3D) Organoide von Mäusen erzeugen, die mit 4NQO behandelt wurden, um murine ESCC oder präneoplastische Zellen ex vivo zu charakterisieren. Diese Organoide erfassen die hervorstechenden Merkmale von ESCC und ösophagealer Präneoplasie, können kostengünstig und schnell zur Bildung isogener Modelle genutzt und für syngene Transplantationsexperimente verwendet werden. Wir zeigen, wie man 3D-Organoide aus normalem, präneoplastischem und SCC-murinem Ösophagusgewebe erzeugt und diese Organoide erhält und kryokonserviert. Die Anwendungen dieser vielseitigen Organoide sind breit gefächert und umfassen die Verwendung von gentechnisch veränderten Mäusen und die weitere Charakterisierung durch Durchflusszytometrie oder Immunhistochemie, die Erzeugung isogener Organoidlinien unter Verwendung von CRISPR-Technologien sowie das Wirkstoffscreening oder die syngene Transplantation. Wir glauben, dass die weit verbreitete Übernahme der in diesem Protokoll demonstrierten Techniken die Fortschritte in diesem Bereich beschleunigen wird, um die schwere Belastung durch ESCC zu bekämpfen.
Introduction
Das Plattenepithelkarzinom des Ösophagus (ESCC) ist aufgrund seiner späten Diagnose, Therapieresistenz und Metastasierung das tödlichste Plattenepithelkarzinom des Menschen 1,2. ESCC entsteht aus dem geschichteten Plattenepithel, das die luminale Oberfläche der Speiseröhre auskleidet. Das Plattenepithel besteht aus proliferativen Basalzellen und differenzierten Zellen innerhalb der suprabasalen Zellschicht. Unter physiologischen Bedingungen exprimieren Basalzellen Marker wie p63, Sox2 und Zytokeratin K5 und K14, während differenzierte Zellen K4, K13 und IVL exprimieren. Basalzellen selbst sind heterogen und umfassen mutmaßliche Stammzellen, die durch Marker wie K153 und CD734 definiert sind. Bei der Homöostase durchlaufen Basalzellen eine postmitotische terminale Differenzierung innerhalb der suprabasalen Zellschicht, während differenzierte Zellen in das Lumen wandern und abschuppen, um die Epithelerneuerung abzuschließen. ESCC erinnert an ihre Ursprungszellen und zeigt in unterschiedlichem Ausmaß eine Plattenepithelzelldifferenzierung. Das ESCC wird häufig von multifokalen histologischen Vorläuferläsionen begleitet, die als intraepitheliale Neoplasien (IEN) oder Dysplasien bezeichnet werden und aus atypischen basaloiden Zellen bestehen. Zusätzlich zu den epithelialen Veränderungen zeigt das ESCC einen Gewebeumbau innerhalb des subepithelialen Kompartiments, wo die Aktivierung von krebsassoziierten Fibroblasten (CAFs) und die Rekrutierung von Immun-/Entzündungszellen stattfinden, um die tumorfördernde Mikroumgebung zu fördern.
Die Pathogenese der ESCC beinhaltet genetische Veränderungen und die Exposition gegenüber umweltbedingten Risikofaktoren. Zu den wichtigsten genetischen Läsionen gehören die Inaktivierung der Tumorsuppressorgene TP53 und CDKN2A (p16INK4A) sowie die Aktivierung der Onkogene CCND1 (Cyclin D1) und EGFR, die in einer beeinträchtigten Funktion des Zellzyklus-Checkpoints, einer aberranten Proliferation und einem Überleben unter genotoxischem Stress im Zusammenhang mit der Exposition gegenüber Umweltkarzinogenen gipfeln. In der Tat stehen genetische Veränderungen in engem Zusammenhang mit Verhaltens- und Umweltrisikofaktoren, am häufigsten Tabak- und Alkoholkonsum. Tabakrauch enthält für den Menschen krebserregende Stoffe wie Acetaldehyd, das auch der Hauptmetabolit von Alkohol ist. Acetaldehyd induziert DNA-Addukte und Interstrang-DNA-Quervernetzungen, was zu DNA-Schäden und der Anhäufung von DNA-Mutationen und chromosomaler Instabilität führt. Angesichts übermäßiger mitogener Stimuli und abweichender Proliferation durch Onkogenaktivierung wird die maligne Transformation von Ösophagusepithelzellen durch Mechanismen zur Bewältigung von genotoxischem Stress erleichtert, einschließlich der Aktivierung von Antioxidantien, Autophagie und epithelial-mesenchymaler Transition (EMT). Interessanterweise werden diese zytoprotektiven Funktionen häufig in ESCC-Krebsstammzellen (CSCs) aktiviert, die sich durch eine hohe CD44 (CD44H)-Expression auszeichnen und die Fähigkeiten zur Tumorinitiierung, -invasion, -metastasierung und -resistenz aufweisen 5,6,7.
ESCC wurde in Zellkultur- und Nagetiermodellenmodelliert 8,9. In den letzten drei Jahrzehnten wurden robuste gentechnisch veränderte Mausmodelle von ESCC entwickelt. Dazu gehören die transgenen CCND1– und EGFR-Mäuse 10,11 sowie die p53– und p120-Ctn-Knockout-Mäuse 12,13. Einzelne genetische Veränderungen führen jedoch in der Regel nicht zu einem rasch einsetzenden ESCC. Diese Herausforderung wurde durch den Einsatz von Ösophaguskarzinogenen überwunden, die die humanen genetischen Läsionen in ESCC14 gut rekapitulieren. Zum Beispiel beschleunigt 4-Nitrochinolin-1-oxid (4NQO) die ESCC-Entwicklung in CCND1-transgenen Mäusen15. In den letzten Jahren wurden mutmaßliche ösophageale Epithelstammzellen, Vorläuferzellen und ihr jeweiliges Schicksal in zelllinienrückverfolgbaren Mausmodellen untersucht 3,4. Darüber hinaus wurden diese Mäuse, die die Zelllinie zurückverfolgen können, verwendet, um die Ursprungszellen von ESCC zu erforschen und zu untersuchen, wie solche Zellen CD44H-CSCs durch konventionelle Histologie und Omics-basierte molekulare Charakterisierung hervorbringen7.
Ein aufstrebendes Gebiet im Zusammenhang mit diesen Mausmodellen ist die neuartige Anwendung von Zellkulturtechniken zur Analyse lebender ESCC- und Vorläuferzellen in einem dreidimensionalen (3D) Organoidsystem, in dem die Architektur des ursprünglichen Gewebes ex vivo rekapituliert wird 7,8,9. Diese 3D-Organoide werden schnell aus einer einzelligen Suspension gezüchtet, die aus murinem Gewebe isoliert wird, einschließlich primärer und metastasierender Tumoren (z. B. Lymphknoten-, Lungen- und Leberläsionen). Die Zellen werden in Basalmembranextrakt (BME) eingebettet und mit einem genau definierten serumfreien Zellkulturmedium gefüttert. Die 3D-Organoide wachsen innerhalb von 7-10 Tagen, und die resultierenden kugelförmigen Strukturen eignen sich für Subkulturen, Kryokonservierung und Assays zur Analyse einer Vielzahl von zellulären Eigenschaften und Funktionen, einschließlich CSC-Markern, EMT, Autophagie, Proliferation, Differenzierung und apoptotischem Zelltod.
Diese Methoden können breit auf 3D-Organoidkulturen angewendet werden, die aus jedem geschichteten Plattenepithelgewebe wie der Kopf- und Halsschleimhaut (Mundhöhle, Zunge, Rachen und Kehlkopf) und sogar dem Vormagen hergestellt werden. Die Kopf- und Halsschleimhaut grenzt an die Speiseröhre, und die beiden Gewebe haben eine ähnliche Gewebeorganisation, Funktion und Anfälligkeit für Krankheiten. Sowohl das Kopf-Hals-Plattenepithelkarzinom (HNSCC) als auch das ESCC teilen genetische Läsionen und lebensstilbedingte Umweltrisikofaktoren wie Tabak- und Alkoholexposition. Um diese Ähnlichkeit zu unterstreichen, entwickeln Mäuse, die mit dem Tabakrauchmimetikum 4NQO behandelt wurden, sowohl HNSCC als auch ESCC. Aufgrund der Leichtigkeit, mit der die unten beschriebenen Protokolle auf die Modellierung von HNSCC angewendet werden können, enthalten wir spezifische Anweisungen für die Etablierung von 3D-Organoidkulturen aus diesen Läsionen.
In dieser Arbeit stellen wir detaillierte Protokolle zur Erzeugung von murinen ösophagealen 3D-Organoiden (MEOs) zur Verfügung, die normale, präneoplastische und ESCC-Läsionen repräsentieren, die sich bei Mäusen entwickeln, die mit 4NQO behandelt wurden. Es können verschiedene Mausstämme verwendet werden, darunter gängige Laborstämme wie C57BL/6 und Zelllinien-rückverfolgbare und andere gentechnisch veränderte Derivate. Wir betonen die wichtigsten Schritte, einschließlich der Isolierung von normalem oder erkranktem murinem Ösophagusepithel, der Herstellung von Einzelzellsuspensionen, der Kultivierung und Überwachung der wachsenden 3D-Organoide, der Subkultur, der Kryokonservierung und der Verarbeitung für nachfolgende Analysen, einschließlich Morphologie und anderer Anwendungen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Es gibt mehrere wichtige Schritte und Überlegungen für die Generierung und Analyse von MEOs in den hier beschriebenen Protokollen. Um die Reproduzierbarkeit und Genauigkeit von MEO-Experimenten zu gewährleisten, sind sowohl biologische als auch technische Replikate wichtig. Für biologische Replikate sind in der Regel zwei bis drei unabhängige Mäuse mit ESCC pro Versuchsbedingung ausreichend. Die angemessene Anzahl biologischer Replikate kann jedoch in Abhängigkeit von den zu testenden Parametern in den einzelnen S…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wir danken den Shared Resources (Durchflusszytometrie, Molekularpathologie und konfokale und spezialisierte Mikroskopie) am Herbert Irving Comprehensive Cancer Center an der Columbia University für die technische Unterstützung. Wir danken Dr. Alan Diehl, Dr. Adam J. Bass und Dr. Kwok-Kin Wong (NCI P01 Mechanismen der Ösophaguskarzinogenese) sowie den Mitgliedern der Laboratorien von Rustgi und Nakagawa für die hilfreichen Diskussionen. Diese Studie wurde durch die folgenden NIH Grants unterstützt: P01CA098101 (H.N. und A.K.R.), R01DK114436 (H.N.), R01AA026297 (H.N.), L30CA264714 (S.F.), DE031112-01 (F.M.H.), KL2TR001874 (F.M.H.),3R01CA255298-01S1 (J.G.), 2L30DK126621-02
(J.G.) R01CA266978 (C.L.), R01DK132251 (C.L.), R01DE031873 (C.L.), P30DK132710 (C.M. und H.N.) und P30CA013696 (A.K.R.). H.N. und C.L. wurden mit dem Herbert Irving Comprehensive Cancer Center Multi-PI Pilot Award der Columbia University ausgezeichnet. H.N. wurde mit dem Fanconi Anemia Research Fund Award ausgezeichnet. F.M.H. wurde mit dem Mark Foundation for Cancer Research Award (20-60-51-MOME) und dem American Association for Cancer Research Award ausgezeichnet. J.G. wurde von der American Gastroenterological Association (AGA) ausgezeichnet.
Materials
| 0.05% trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25-300-120 | |
| 0.25% trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25-200-114 | |
| 0.4% Trypan Blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | |
| 1 mL tuberculin syringe without needle | BD | 309659 | |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 100 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22363549 | |
| 15 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 14-959-53A | |
| 200 µL wide bore micropipette tips | Thermo Fisher Scientific | 212361A | |
| 21 G needles | BD | 305167 | |
| 24 well plate | Thermo Fisher Scientific | 12-556-006 | |
| 4-Nitroquinoline-1-oxide (4NQO) | Tokyo Chemical Industry | NO250 | |
| 50 mL conical tubes | Thermo Fisher Scientific | 12-565-270 | |
| 6 well plate | Thermo Fisher Scientific | 12556004 | |
| 70 µm cell strainer | Thermo Fisher Scientific | 22363548 | |
| 99.9% ethylene propylene glycol | SK picglobal | ||
| Advanced DMEM/F12 | Thermo Fisher Scientific | 12634028 | |
| Amphotericin B | Gibco, Thermo Fisher Scientific | 15290018 | Stock concentration 250 µg/mL, final concentration 0.5 µg/mL |
| Antibiotic-Antimycotic | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| B-27 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | Stock concentration 50x, final concentration 1x |
| Bacto agar | BD | 214010 | |
| CO2 incubator, e.g.Heracell 150i | Thermo Fisher Scientific | 51026406 | or equivalent |
| Countess II FL Automated Cell Counter | Thermo Fisher Scientific | AMQAX1000 | or equivalent |
| Cryovials | Thermo Fisher Scientific | 03-337-7D | |
| DietGel 76A | Clear H2O | 72-07-5022 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | MilliporeSigma | D4540 | |
| Dispase | Corning | 354235 | Stock concentration 50 U/mL, final concentration 2.5–5 U/mL |
| Dissecting scissors | VWR | 25870-002 | |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 14190250 | Stock concentration 1x |
| Fetal bovine serum (FBS) | HyClone | SH30071.03 | |
| Forceps | VWR | 82027-386 | |
| Freezing container | Corning | 432002 | or equivalent |
| Gelatin | Thermo Fisher Scientific | G7-500 | |
| GlutaMAX | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | 15630080 | Stock concentration 1 M, final concentration 10 mM |
| Hot plate/stirrer | Corning | PC-420D | or equivalent |
| Lab Armor bead bath (or water bath) | VWR | 89409-222 | or equivalent |
| Laboratory balance | Ohaus | 71142841 | or equivalent |
| Matrigel basement membrane extract (BME) | Corning | 354234 | |
| Microcentrifuge Minispin | Eppendorf | 22620100 | or equivalent |
| Microcentrifuge tube rack | Southern Labware | 0061 | |
| N-2 supplement | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | Stock concentration 100x, final concentration 1x |
| N-acetylcysteine (NAC) | Sigma-Aldrich | A9165 | Stock concentration 0.5 M, final concentration 1 mM |
| Parafilm M wrap | Thermo Fisher Scientific | S37440 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | MilliporeSigma | 158127-500G | |
| Pathology cassette | Thermo Fisher Scientific | 22-272416 | |
| Phase-contrast microscope | Nikon | or equivalent | |
| Recombinant mouse epidermal growth factor (mEGF) | Peprotech | 315-09-1mg | Stock concentration 500 ng/µL, final concentration 100 ng/mL |
| RN cell-conditioned medium expressing R-Spondin1 and Noggin (RN CM) | N/A | N/A | Available through the Organoid and Cell Culture Core upon request, final concentration 2% |
| Sorval ST 16R centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 75004380 | or equivalent |
| Soybean trypsin inhibitor (STI) | MilliporeSigma | T9128 | Stock concentration 250 µg/mL |
| ThermoMixer C | Thermo Fisher Scientific | 14-285-562 PM | or equivalent |
| Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | Stock concentration 10 mM, final concentration 10 µM |
Referências
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