Her demonstrerer vi forberedelsen af en højkvalitets enkeltcellesuspension af tilapiattarm til enkeltcellesekventering.
Nilen tilapia er en af de mest almindeligt dyrkede ferskvandsfiskearter på verdensplan og er en udbredt forskningsmodel til akvakulturfiskstudier. Fremstillingen af enkeltcellesuspensioner af høj kvalitet er afgørende for undersøgelser på enkeltcelleniveau såsom enkeltcelle-RNA eller genomsekventering. Der findes imidlertid ingen brugsklar protokol for akvakulturfiskearter, især for tarmen i tilapia. De effektive dissociationsenzymer varierer afhængigt af vævstypen. Derfor er det vigtigt at optimere vævsdissociationsprotokollen ved at vælge den passende enzym- eller enzymkombination for at opnå nok levedygtige celler med minimal skade. Denne undersøgelse illustrerer en optimeret protokol til fremstilling af en højkvalitets enkeltcellesuspension fra Nile tilapia tarm med en enzymkombination af collagenase/dispase. Denne kombination er yderst effektiv til dissociation med udnyttelsen af bovin serumalbumin og DNase for at reducere celleaggregering efter fordøjelse. Celleudgangen opfylder kravene til enkeltcellesekventering med 90% cellelevedygtighed og en høj cellekoncentration. Denne protokol kan også modificeres til fremstilling af en enkeltcellesuspension fra tarmene fra andre fiskearter. Denne forskning giver en effektiv referenceprotokol og reducerer behovet for yderligere forsøg med fremstilling af encellede suspensioner til akvakulturfiskearter.
Celler er de grundlæggende enheder af organismer. Sammenlignet med bulkvævsundersøgelser kan undersøgelser på enkeltcelleniveau afspejle celleheterogenitet og give oplysninger med højere opløsning1. I de senere år har forskere anvendt enkeltcellesekventeringsteknologier til genom-, transkriptom-, epigenom- eller multi-omiske undersøgelser på enkeltcelleniveau hos pattedyr, zebrafisk og andre modelorganismer og rapporteret store gennembrud 2,3,4,5,6,7 . Mens de fleste undersøgelser har fokuseret på modelorganismer, er der få referenceprotokoller eller kommercielle dissociationssæt til enkeltcellesekventering i økonomiske fiskearter, hvilket begrænser anvendelsen af enkeltcellesekventering i akvakulturforskning. Derfor er det afgørende at udvikle vævsdissociationsprotokoller, der producerer enkeltcellesuspensioner af høj kvalitet med høj cellelevedygtighed og nukleinsyreintegritet.
Det er vigtigt at optimere vævsdissociationsprotokollen med den passende enzym- eller enzymkombination for at opnå nok levedygtige celler med minimal skade. Det mest effektive enzym til vævsdissociation varierer afhængigt af vævstypen. Hos pattedyr er flere enzymer blevet anvendt til fremstilling af enkeltcellesuspensioner til pattedyrs faste væv, herunder collagenase, dispase, trypsin, papain, elastase, hyaluronidase, liberase, accutase og trypLE 8,9. Trypsin fordøjelse kombineret med mekanisk forstyrrelse har almindeligvis været anvendt til at dissociere væv til cellekultur i fisk 10,11,12,13,14. Trypsin er også blevet brugt eller tilsat i fordøjelsescocktailen til vævsdissociation i rottetarmen15 og zebrafiskens gællevæv16. Af flere grunde er trypsin imidlertid ikke den bedste mulighed for enkeltcellesekventering. Trypsin alene er normalt ineffektivt til vævsdissociation. Derudover inducerer trypsin DNA-strengbrud 17,18 og RNA-nedbrydning19.
Papain nedbryder proteinerne, der udgør de tætte kryds mellem celler. I pattedyrs nerve- og glatte muskelceller er papain mere effektiv og mindre destruktiv end andre proteaser20,21. Men ligesom trypsin resulterer papain i den frie DNA-inducerede aggregering af celler på grund af cellelyse, der opstår under enzymatisk fordøjelse9. Elastase nedbryder elastin, som typisk findes i hud, lunger, ledbånd, sener og vaskulært væv22. Det bruges ofte i kombination med collagenase, dispase eller trypsin til dissociering af lungevæv8. Hyaluronidase spalter hyaluronans glycosidbindinger, hvilket bidrager til fordøjelsen af den ekstracellulære matrix i forskellige bindevæv og hud 9,23.
Generelt er collagenase og dispase gode muligheder for ekstracellulær matrixnedbrydning. De er blevet brugt til dissociation af tarme fra mennesker, mus og zebrafisk 24,25,26,27. Collagenase ødelægger peptidbindingen i kollagen, fremmer fordøjelsen af den ekstracellulære matrix og frigiver cellerne i suspension, og således anvendes collagenase ofte til human og mus fast vævsdissociation, herunder til leveren 28,29, milt30, bugspytkirtlen31 og tarmen 25. Dispase er en protease, der hydrolyserer de N-terminale peptidbindinger af ikke-polære aminosyrerester og er mildere end collagenase. Det spalter de ekstracellulære matrixkomponenter, såsom fibronectin, type IV kollagen og i mindre grad type I kollagen, uden at påvirke celle-celle krydsninger. Dispase anvendes separat eller sammen med andre enzymer til vævsdissociation, såsom tarm25,32, hjerne33, lever 34 osv. Derudover er kommercielt tilgængelige fordøjelsescocktails, herunder liberase, accutase og trypLE, også gode alternativer til dissociation af fast væv, især for hud, lever og nyre 8,9.
Nile tilapia (Oreochromis niloticus) tilhører familien Cichlidae af ordren Perciformes. Det er en af de mest dyrkede ferskvandsfiskearter i tropiske og subtropiske områder med en årlig produktion på 4,5 millioner tons i 202235. Det er en af de bedst undersøgte akvakulturfiskearter med et godt kommenteret genom. Nilen tilapia er en ideel forskningsmodel for akvakulturfiskearter på grund af dens korte generationstid, lette opdræt og tilpasningsevne til en bred vifte af opdrætsmiljøer. Tarmen er af stor forskningsinteresse, da det er organet for ernæring, fordøjelse og absorption, stofskifte og slimhindeimmunitet. Tarmen er levested for mikrobielle populationer og er et essentielt immunvæv36. Det er immunologisk aktivt på grund af tilstedeværelsen af adskillige immuncelletyper, herunder makrofager, B-celler, granulocytter og T-celler.
I den aktuelle undersøgelse udviklede vi en protokol til fremstilling af en højkvalitets enkeltcellesuspension fra Nilens tilapiatarm for at lette enkeltcelleniveauundersøgelser i akvakulturfiskearter. Ifølge egenskaberne ved disse vævsspecifikke enzymer og indledende arbejde er collagenase/dispase egnet til dissociering af tilapia tarmvæv. Den sidste enzymtype, der skal overvejes ved fremstilling af enkeltcellesuspensioner, er DNase-I, som forhindrer celleaggregering ved at nedbryde frit DNA frigivet gennem død cellelyse under enzymatisk fordøjelse uden at initiere apoptotiske veje9 og øger det levende celleudbytte36. Derudover tilsættes bovint serumalbumin (BSA) til vaskebufferen for at reducere celleklumpning og forbedre cellelevedygtigheden. Flere reagensfirmaer beskriver BSA som en enzymstabilisator. Tilsætningen af 0,04%-1% BSA til PBS (fosfatbufret saltvand) er blevet anvendt til at udvikle en vaskeopløsning til fremstilling af enkeltcellesekventeringssuspensioner uden skadelige virkninger38. Tilføjelsen af et lavt forhold mellem BSA kan hjælpe med at opretholde cellelevedygtighed og undgå den frie DNA-inducerede aggregering af celler på grund af cellelyse. Denne protokol kan også udgøre en værdifuld reference for udvikling af celledissociationsprotokoller fra tarmene hos andre akvakulturfiskearter.
Denne protokol beskriver fremstillingen af en højkvalitets enkeltcellesuspension af Nile tilapia tarm. Før dissociation er fjernelse af fedt og mesenteri fra tarmen nødvendig, især for kødædende fisketarme med meget fedt. Brug af en sprøjte i stedet for hård skrabning for at vaske tarmindholdet reducerer den mekaniske skade på cellerne. For at sikre cellernes levedygtighed er det også vigtigt at holde temperaturen på 20 °C eller derunder i vævsdissektions- og skylletrinnene. Vaskeopløsningerne afkøles på …
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne ønsker at anerkende støtte fra Hainan Provincial Natural Science Foundation of China (NO. 320QN211) og Research Fund Program of Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Animal Disease Control and Healthy Culture of China (NO. PBEA2021ZD01).
0.22-μm Sterile Filter | Solarbio Life Sciences | SLGV033RB | It is used to filter and sterilize the enzyme solution. |
40-μm Cell Strainer | Solarbio Life Sciences | F8200 | Cell Strainer is applied to eliminate undigested tissue pieces. |
Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | SRE0098 | Powder; dilute 0.04 g BSA with 100 mL 1× DPBS to prepare 0.04% BSA-DPBS washing bffer. Store at 2 – 8 °C. |
Collagenase II | Sangon Biotech | A004202 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
Collagenase/dispase | Roche | 10269638-001 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
Dispase | Sigma-Aldrich | D4818 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |
DNase I | Sigma-Aldrich | AMPD1 | DNase I helps reduce cell clumping. |
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca2+/Mg2+-free | Solarbio Life Sciences | E607009-0500 | Store at room temperature. |
Elastase | Sangon Biotech | A600438 | Dilute with PBS to a final concentration of 0.5 mg/mL. |
Fetal bovine serum (FBS) | Gibco | 16000-044 | Serum, used at volume of 5% in digetstion solution. |
Inverted Microscope | Leica | qTOWER3G | It is used to examine cell viability. |
Liberase | Roche | 5401119001 | Dilute with PBS to a final concentration of 0.25 mg/mL. |
Nile tilpia (Oreochromis niloticus) | ProGift Aquaculture Technology Co. Ltd. | NA | Healthy fish with no disease signs (Mean body weight: 100 g). |
Phosphate-buffered saline (PBS) | Solarbio Life Sciences | P1020 | Store at room temperature. |
Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | 5424 | It is used to spin down the tissue and cell petet. |
RNase inhibitor | NEB | M0314L | Inhibit RNase activity |
Solid-phase RNase-Be-Gone Reagent | Sangon Biotech | B644201-0050 | It is used to remove the RNase from tools such as dissecting scissors and glass pipettes. Store at room temperature. |
Tricaine methanesulfonate (MS-222) | Sigma-Aldrich | E10521 | For fish euthanasia. |
Trypan Blue | Invitrogen | C0040 | It is used for staining dead cells. |
Trypsin | Sangon Biotech | E607001 | Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL. |