JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Biology

Enkeltcellesuspensionspræparat fra Nile Tilapia-tarm til enkeltcellesekventering

Published: February 10, 2023
doi:
10.3791/64688
, , , , , ,
1State Key Laboratory of Marine Resource Utilization in South China Sea,Hainan University, 2Provincial Key Laboratory of Aquatic Animal Disease Control and Healthy Culture, College of Fishery,Guangdong Ocean University, 3Hainan Provincial Key Laboratory for Tropical Hydrobiology and Biotechnology, College of Marine Science,Hainan University, 4Department of Animal Wealth Development, Faculty of Veterinary Medicine,Suez Canal University

Summary

Her demonstrerer vi forberedelsen af en højkvalitets enkeltcellesuspension af tilapiattarm til enkeltcellesekventering.

Abstract

Nilen tilapia er en af de mest almindeligt dyrkede ferskvandsfiskearter på verdensplan og er en udbredt forskningsmodel til akvakulturfiskstudier. Fremstillingen af enkeltcellesuspensioner af høj kvalitet er afgørende for undersøgelser på enkeltcelleniveau såsom enkeltcelle-RNA eller genomsekventering. Der findes imidlertid ingen brugsklar protokol for akvakulturfiskearter, især for tarmen i tilapia. De effektive dissociationsenzymer varierer afhængigt af vævstypen. Derfor er det vigtigt at optimere vævsdissociationsprotokollen ved at vælge den passende enzym- eller enzymkombination for at opnå nok levedygtige celler med minimal skade. Denne undersøgelse illustrerer en optimeret protokol til fremstilling af en højkvalitets enkeltcellesuspension fra Nile tilapia tarm med en enzymkombination af collagenase/dispase. Denne kombination er yderst effektiv til dissociation med udnyttelsen af bovin serumalbumin og DNase for at reducere celleaggregering efter fordøjelse. Celleudgangen opfylder kravene til enkeltcellesekventering med 90% cellelevedygtighed og en høj cellekoncentration. Denne protokol kan også modificeres til fremstilling af en enkeltcellesuspension fra tarmene fra andre fiskearter. Denne forskning giver en effektiv referenceprotokol og reducerer behovet for yderligere forsøg med fremstilling af encellede suspensioner til akvakulturfiskearter.

Introduction

Celler er de grundlæggende enheder af organismer. Sammenlignet med bulkvævsundersøgelser kan undersøgelser på enkeltcelleniveau afspejle celleheterogenitet og give oplysninger med højere opløsning1. I de senere år har forskere anvendt enkeltcellesekventeringsteknologier til genom-, transkriptom-, epigenom- eller multi-omiske undersøgelser på enkeltcelleniveau hos pattedyr, zebrafisk og andre modelorganismer og rapporteret store gennembrud 2,3,4,5,6,7 . Mens de fleste undersøgelser har fokuseret på modelorganismer, er der få referenceprotokoller eller kommercielle dissociationssæt til enkeltcellesekventering i økonomiske fiskearter, hvilket begrænser anvendelsen af enkeltcellesekventering i akvakulturforskning. Derfor er det afgørende at udvikle vævsdissociationsprotokoller, der producerer enkeltcellesuspensioner af høj kvalitet med høj cellelevedygtighed og nukleinsyreintegritet.

Det er vigtigt at optimere vævsdissociationsprotokollen med den passende enzym- eller enzymkombination for at opnå nok levedygtige celler med minimal skade. Det mest effektive enzym til vævsdissociation varierer afhængigt af vævstypen. Hos pattedyr er flere enzymer blevet anvendt til fremstilling af enkeltcellesuspensioner til pattedyrs faste væv, herunder collagenase, dispase, trypsin, papain, elastase, hyaluronidase, liberase, accutase og trypLE 8,9. Trypsin fordøjelse kombineret med mekanisk forstyrrelse har almindeligvis været anvendt til at dissociere væv til cellekultur i fisk 10,11,12,13,14. Trypsin er også blevet brugt eller tilsat i fordøjelsescocktailen til vævsdissociation i rottetarmen15 og zebrafiskens gællevæv16. Af flere grunde er trypsin imidlertid ikke den bedste mulighed for enkeltcellesekventering. Trypsin alene er normalt ineffektivt til vævsdissociation. Derudover inducerer trypsin DNA-strengbrud 17,18 og RNA-nedbrydning19.

Papain nedbryder proteinerne, der udgør de tætte kryds mellem celler. I pattedyrs nerve- og glatte muskelceller er papain mere effektiv og mindre destruktiv end andre proteaser20,21. Men ligesom trypsin resulterer papain i den frie DNA-inducerede aggregering af celler på grund af cellelyse, der opstår under enzymatisk fordøjelse9. Elastase nedbryder elastin, som typisk findes i hud, lunger, ledbånd, sener og vaskulært væv22. Det bruges ofte i kombination med collagenase, dispase eller trypsin til dissociering af lungevæv8. Hyaluronidase spalter hyaluronans glycosidbindinger, hvilket bidrager til fordøjelsen af den ekstracellulære matrix i forskellige bindevæv og hud 9,23.

Generelt er collagenase og dispase gode muligheder for ekstracellulær matrixnedbrydning. De er blevet brugt til dissociation af tarme fra mennesker, mus og zebrafisk 24,25,26,27. Collagenase ødelægger peptidbindingen i kollagen, fremmer fordøjelsen af den ekstracellulære matrix og frigiver cellerne i suspension, og således anvendes collagenase ofte til human og mus fast vævsdissociation, herunder til leveren 28,29, milt30, bugspytkirtlen31 og tarmen 25. Dispase er en protease, der hydrolyserer de N-terminale peptidbindinger af ikke-polære aminosyrerester og er mildere end collagenase. Det spalter de ekstracellulære matrixkomponenter, såsom fibronectin, type IV kollagen og i mindre grad type I kollagen, uden at påvirke celle-celle krydsninger. Dispase anvendes separat eller sammen med andre enzymer til vævsdissociation, såsom tarm25,32, hjerne33, lever 34 osv. Derudover er kommercielt tilgængelige fordøjelsescocktails, herunder liberase, accutase og trypLE, også gode alternativer til dissociation af fast væv, især for hud, lever og nyre 8,9.

Nile tilapia (Oreochromis niloticus) tilhører familien Cichlidae af ordren Perciformes. Det er en af de mest dyrkede ferskvandsfiskearter i tropiske og subtropiske områder med en årlig produktion på 4,5 millioner tons i 202235. Det er en af de bedst undersøgte akvakulturfiskearter med et godt kommenteret genom. Nilen tilapia er en ideel forskningsmodel for akvakulturfiskearter på grund af dens korte generationstid, lette opdræt og tilpasningsevne til en bred vifte af opdrætsmiljøer. Tarmen er af stor forskningsinteresse, da det er organet for ernæring, fordøjelse og absorption, stofskifte og slimhindeimmunitet. Tarmen er levested for mikrobielle populationer og er et essentielt immunvæv36. Det er immunologisk aktivt på grund af tilstedeværelsen af adskillige immuncelletyper, herunder makrofager, B-celler, granulocytter og T-celler.

I den aktuelle undersøgelse udviklede vi en protokol til fremstilling af en højkvalitets enkeltcellesuspension fra Nilens tilapiatarm for at lette enkeltcelleniveauundersøgelser i akvakulturfiskearter. Ifølge egenskaberne ved disse vævsspecifikke enzymer og indledende arbejde er collagenase/dispase egnet til dissociering af tilapia tarmvæv. Den sidste enzymtype, der skal overvejes ved fremstilling af enkeltcellesuspensioner, er DNase-I, som forhindrer celleaggregering ved at nedbryde frit DNA frigivet gennem død cellelyse under enzymatisk fordøjelse uden at initiere apoptotiske veje9 og øger det levende celleudbytte36. Derudover tilsættes bovint serumalbumin (BSA) til vaskebufferen for at reducere celleklumpning og forbedre cellelevedygtigheden. Flere reagensfirmaer beskriver BSA som en enzymstabilisator. Tilsætningen af 0,04%-1% BSA til PBS (fosfatbufret saltvand) er blevet anvendt til at udvikle en vaskeopløsning til fremstilling af enkeltcellesekventeringssuspensioner uden skadelige virkninger38. Tilføjelsen af et lavt forhold mellem BSA kan hjælpe med at opretholde cellelevedygtighed og undgå den frie DNA-inducerede aggregering af celler på grund af cellelyse. Denne protokol kan også udgøre en værdifuld reference for udvikling af celledissociationsprotokoller fra tarmene hos andre akvakulturfiskearter.

Protocol

Alle dyreprotokoller under denne undersøgelse blev godkendt af Hainan University Institutional Animal Care and Use Committee (protokolnummer: HNUAUCC-2022-00063; Godkendelsesdato: 2022-03-03). En liste over udstyr og forsyninger, der anvendes i dette eksperiment, findes i materialefortegnelsen. Et resumé af den nuværende protokol er illustreret i figur 1. 1. Tilberedning af fisk Få 6 måneder gammel Nile tilapia med …

Representative Results

Denne protokol beskriver fremstillingen af en højkvalitets enkeltcellesuspension af Nile tilapiatarm til enkeltcellesekventering (figur 1). Denne forskning viser, at collagenase/dispase-blandingen har en god dissociationseffekt og er mild for tarmvæv. Valget af det optimale fordøjelsesenzym er afgørende for at fremstille en højkvalitets enkeltcellesuspension. I det indledende arbejde blev dissociationseffektiviteten af flere almindeligt anvendte enzymer sammenlignet, og resultaterne er …

Discussion

Denne protokol beskriver fremstillingen af en højkvalitets enkeltcellesuspension af Nile tilapia tarm. Før dissociation er fjernelse af fedt og mesenteri fra tarmen nødvendig, især for kødædende fisketarme med meget fedt. Brug af en sprøjte i stedet for hård skrabning for at vaske tarmindholdet reducerer den mekaniske skade på cellerne. For at sikre cellernes levedygtighed er det også vigtigt at holde temperaturen på 20 °C eller derunder i vævsdissektions- og skylletrinnene. Vaskeopløsningerne afkøles på …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne ønsker at anerkende støtte fra Hainan Provincial Natural Science Foundation of China (NO. 320QN211) og Research Fund Program of Guangdong Provincial Key Laboratory of Aquatic Animal Disease Control and Healthy Culture of China (NO. PBEA2021ZD01).

Materials

0.22-μm Sterile Filter Solarbio Life Sciences SLGV033RB It is used to filter and sterilize the enzyme solution.
40-μm Cell Strainer Solarbio Life Sciences F8200 Cell Strainer is applied to eliminate undigested tissue pieces.
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich SRE0098 Powder; dilute 0.04 g BSA with 100 mL 1× DPBS to prepare 0.04% BSA-DPBS washing bffer. Store at 2 – 8 °C.
Collagenase II Sangon Biotech A004202 Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
Collagenase/dispase Roche 10269638-001 Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
Dispase Sigma-Aldrich D4818 Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
DNase I Sigma-Aldrich AMPD1 DNase I helps reduce cell clumping.
Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS), Ca2+/Mg2+-free Solarbio Life Sciences E607009-0500 Store at room temperature.
Elastase Sangon Biotech A600438 Dilute with PBS to a final concentration of 0.5 mg/mL.
Fetal bovine serum (FBS) Gibco 16000-044 Serum, used at volume of 5% in digetstion solution.
Inverted Microscope Leica qTOWER3G It is used to examine cell viability.
Liberase Roche 5401119001 Dilute with PBS to a final concentration of 0.25 mg/mL.
Nile tilpia (Oreochromis niloticus) ProGift Aquaculture Technology Co. Ltd. NA Healthy fish with no disease signs (Mean body weight: 100 g). 
Phosphate-buffered saline (PBS) Solarbio Life Sciences P1020 Store at room temperature.
Refrigerated Centrifuge Eppendorf 5424 It is used to spin down the tissue and cell petet.
RNase inhibitor NEB M0314L Inhibit RNase activity
Solid-phase RNase-Be-Gone Reagent Sangon Biotech B644201-0050 It is used to remove the RNase from tools such as dissecting scissors and glass pipettes. Store at room temperature.
Tricaine methanesulfonate (MS-222) Sigma-Aldrich E10521 For fish euthanasia. 
Trypan Blue Invitrogen C0040 It is used for staining dead cells.
Trypsin Sangon Biotech E607001 Dilute with PBS to a final concentration of 1 mg/mL.
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Tang, X., Huang, Y., Lei, J., Luo, H., Zhu, X. The single-cell sequencing: new developments and medical applications. Cell and Bioscience. 9 (1), (2019).
  2. He, H., et al. Single-cell transcriptome analysis of human skin identifies novel fibroblast subpopulation and enrichment of immune subsets in atopic dermatitis. The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 145 (6), 1615-1628 (2020).
  3. Carmona, S. J., et al. Single-cell transcriptome analysis of fish immune cells provides insight into the evolution of vertebrate immune cell types. Genome Research. 27 (3), 451-461 (2017).
  4. Wen, L., Tang, F. C. Single cell epigenome sequencing technologies. Molecular Aspects of Medicine. 59, 62-69 (2018).
  5. Xu, R., et al. Single cell sequencing coupled with bioinformatics reveals PHYH as a potential biomarker in kidney ischemia reperfusion injury. Biochemical and Biophysical Research Communications. 602, 156-162 (2022).
  6. Potter, S. S. Single-cell RNA sequencing for the study of development, physiology and disease. Nature Reviews Nephrology. 14 (8), 479-492 (2018).
  7. Andrews, T. S., Hemberg, M. Identifying cell populations with scRNASeq. Molecular Aspects of Medicine. 59, 114-122 (2018).
  8. Lafzi, A., Moutinho, C., Picelli, S., Heyn, H. Tutorial: Guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies. Nature Protocols. 13 (12), 2742-2757 (2018).
  9. Reichard, A., Asosingh, K. Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry. Cytometry Part A. 95 (2), 219-226 (2019).
  10. Sathiyanarayanan, A., Goswami, M., Nagpure, N., Babu, P. G., Das, D. K. Development and characterization of a new gill cell line from the striped catfish, Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage, 1878). Fish Physiology and Biochemistry. 48 (2), 367-380 (2022).
  11. Ager-Wick, E., et al. Preparation of a high-quality primary cell culture from fish pituitaries. Journal of Visualized Experiments. (138), e58159 (2018).
  12. Kumar, R., et al. Establishment and characterization of a caudal fin-derived cell line, AOF, from the Oscar, Astronotus ocellatus. FishPhysiology and Biochemistry. 45 (1), 123-131 (2019).
  13. Schnell, S., et al. Procedures for the reconstruction, primary culture and experimental use of rainbow trout gill epithelia. Nature Protocols. 11 (3), 490-498 (2016).
  14. Xu, S. H., Cooke, I. M. Voltage-gated currents of tilapia prolactin cells. General and Comparative Endocrinology. 150 (2), 219-232 (2007).
  15. Ayyaz, A., et al. Single-cell transcriptomes of the regenerating intestine reveal a revival stem cell. Nature. 569 (7754), 121-125 (2019).
  16. Pan, W., et al. Single-cell transcriptomic analysis of neuroepithelial cells and other cell types of the gills of zebrafish (Danio rerio) exposed to hypoxia. Scientific Reports. 12, 10144 (2022).
  17. Huang, H. L., et al. Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells. Journal of Biomedical Science. 17 (1), 36 (2010).
  18. Kapiszewska, M., Reddy, N. M., Lange, C. S. Trypsin-induced changes in cell shape and chromatin structure result in radiosensitization of monolayer Chinese hamster V79 cells. International Journal of Radiation Biology. 60 (4), 635-646 (1991).
  19. Vrtačnik, P., Kos, &. #. 3. 5. 2. ;., Bustin, S. A., Marc, J., Ostanek, B. Influence of trypsinization and alternative procedures for cell preparation before RNA extraction on RNA integrity. Analytical Biochemistry. 463, 38-44 (2014).
  20. Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. The Journal of Neuroscience. 6 (10), 3044-3060 (1986).
  21. Kinoshita, K., Sato, K., Hori, M., Ozaki, H., Karaki, H. Decrease in activity of smooth muscle L-type Ca2+ channels and its reversal by NF-kappaB inhibitors in Crohn’s colitis model. American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 285 (3), 483-493 (2003).
  22. Chung, M. I., et al. Sequences and domain structures of mammalian, avian, amphibian and teleost tropoelastins: Clues to the evolutionary history of elastins. Matrix Biology. 25 (8), 492-504 (2006).
  23. Berry, M. N., Friend, D. S. High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: A biochemical and fine structural study. Journal of Cell Biology. 43 (3), 506-520 (1969).
  24. Merlos-Suárez, A., et al. The intestinal stem cell signature identifies colorectal cancer stem cells and predicts disease relapse. Cell Stem Cell. 8 (5), 511-524 (2011).
  25. Glass, L. L., et al. Single-cell RNA sequencing reveals a distinct population of proglucagon-expressing cells specific to the mouse upper small intestine. Molecular Metabolism. 6 (10), 1296-1303 (2017).
  26. Herring, C. A., et al. Unsupervised trajectory analysis of single-cell RNA-seq and imaging data reveals alternative tuft cell origins in the gut. Cell Systems. 6 (1), 37-51 (2018).
  27. Gu, W., et al. Single-cell RNA sequencing reveals size-dependent effects of polystyrene microplastics on immune and secretory cell populations from zebrafish intestines. Environmental Science & Technology. 54 (6), 3417-3427 (2020).
  28. Yang, W., et al. Single-cell transcriptomic analysis reveals a hepatic stellate cell-activation roadmap and myofibroblast origin during liver fibrosis in mice. Hepatology. 74 (5), 2774-2790 (2021).
  29. Howard, R. B., et al. The enzymatic preparation of isolated intact parenchymal cells from rat liver. Journal of Cell Biology. 35 (3), 675-684 (1967).
  30. Pezoldt, J., et al. Single-cell transcriptional profiling of splenic fibroblasts reveals subset-specific innate immune signatures in homeostasis and during viral infection. Communications Biology. 4 (1), 1355 (2021).
  31. Baron, M., et al. A single-cell transcriptomic map of the human and mouse pancreas reveals inter- and intra-cell population structure. Cell Systems. 3 (4), 346-360 (2016).
  32. Barriga, F. M., et al. Mex3a Marks a slowly dividing subpopulation of Lgr5+ intestinal stem cells. Cell Stem Cell. 20 (6), 801-816 (2017).
  33. Volovitz, I., et al. A non-aggressive, highly efficient, enzymatic method for dissociation of human brain-tumors and brain-tissues to viable single-cells. BMC Neuroscience. 17 (1), 30 (2016).
  34. Chen, L., et al. Combined effects of arsenic and 2,2-dichloroacetamide on different cell populations of zebrafish liver. Science of the Total Environment. 821, 152961 (2022).
  35. FAO. The state of world fisheries and aquaculture 2022. Towards blue transformation. Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO). , (2022).
  36. Beck, B. H., Peatman, E. . Mucosal Health in Aquaculture. , (2015).
  37. Leelatian, N., et al. A Single cell analysis of human tissues and solid tumors with mass cytometry. Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 92 (1), 68-78 (2017).
  38. Lee, H., Engin, F. Preparing highly viable single-cell suspensions from mouse pancreatic islets for single-cell RNA sequencing. STAR Protocols. 1 (3), 100144 (2020).
  39. Bresciani, E., Broadbridge, E., Liu, P. P. An efficient dissociation protocol for generation of single cell suspension from zebrafish embryos and larvae. MethodsX. 5, 1287-1290 (2018).
  40. Denisenko, E., et al. Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows. Genome Biology. 21 (1), 130 (2020).
  41. vanden Brink, S. C., et al. Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations. Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).
  42. Avey, D., et al. Single-cell RNA-seq uncovers a robust transcriptional response to morphine by glia. Cell Reports. 24 (13), 3619-3629 (2018).
  43. Herring, C. A., et al. Unsupervised trajectory analysis of single-cell RNA-seq and imaging data reveals alternative tuft cell origins in the gut. Cell Systems. 6 (1), 37-51 (2018).

Tags

Single-cell SuspensionNile TilapiaIntestineSingle-cell SequencingEnzymatic Cell DissociationCollagenase DispasePBSFBSIntestinal ContentsMucusBSA-DPBSRNA InhibitorCell Strainer
check_url/64688?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Wang, P., Zhou, Y., Wang, B., Elaswad, A., Wang, S., Guo, W., Zhang, D. Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing. J. Vis. Exp. (192), e64688, doi:10.3791/64688 (2023).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image